重組腺病毒疫苗株高適應(yīng)性hek293克隆細(xì)胞株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明設(shè)及克隆細(xì)胞株，尤其設(shè)及肥K293克隆細(xì)胞株，本發(fā)明還設(shè)及所述肥K293 克隆細(xì)胞株在培養(yǎng)重組腺病毒rAdV-SFV-E2株中的應(yīng)用，屬于肥K293細(xì)胞的克隆和應(yīng)用領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬攝（Classicalswinefever,CS巧是危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一，被世界 動(dòng)物衛(wèi)生組織（01巧列為OIE動(dòng)物疫病名錄，中國(guó)將其列為一類(lèi)傳染病。自20世紀(jì)50年 代末推廣使用豬攝兔化弱毒疫苗W來(lái)，有效地控制了CSF在中國(guó)大面積爆發(fā)和流行。但近 幾年，中國(guó)豬攝的發(fā)病率又呈上升趨勢(shì)，其流行特點(diǎn)也發(fā)生了重大改變，W溫和型豬攝和母 豬持續(xù)感染所引起的流產(chǎn)、死胎和新生仔豬死亡等為主，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。 豬攝兔化弱毒疫苗存在一些不足，給該病的凈化及根除帶來(lái)了許多困難。首先，現(xiàn)行豬攝弱 毒疫苗的生產(chǎn)工藝存在較多問(wèn)題，用于生產(chǎn)疫苗的轄牛睪丸細(xì)胞和轄牛血清經(jīng)常污染BVDV 或其抗體，嚴(yán)重影響豬攝疫苗的效價(jià)和質(zhì)量；其次，弱毒疫苗接種時(shí)受豬攝母源抗體干擾， 如果免疫程序不當(dāng)，容易造成免疫失敗、先天性感染、隱性感染或免疫耐受。因此，研究一種 安全有效的新型豬攝疫苗是當(dāng)務(wù)之急。
[0003] W活病毒為載體的疫苗，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)目的抗原的免疫應(yīng)答，是一種極具 開(kāi)發(fā)前景的新型疫苗。重組腺病毒可模仿病毒天然的感染方式，并直接在體內(nèi)表達(dá)天然的、 具有生物活性的抗原蛋白，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。近年 來(lái)，W重組腺病毒作為載體攜帶外源基因的新型疫苗研究越來(lái)越受到人們的關(guān)注。由本發(fā) 明人所在團(tuán)隊(duì)研制的腺病毒/甲病毒復(fù)制子嵌合載體豬攝基因工程疫苗rAdV-SFV-E2株， 結(jié)合了腺病毒載體高效遞送和甲病毒復(fù)制子載體高效表達(dá)外源基因的功能。該疫苗株高度 安全，且免疫效力與豬攝兔化弱毒疫苗C株相當(dāng)，并克服了C株疫苗的一些缺陷，如生產(chǎn)工 藝、母源抗體干擾、不同疫苗免疫時(shí)相互干擾等。
[0004] 由于復(fù)制缺陷型重組腺病毒的增殖需要在可反式提供缺失蛋白的肥K293細(xì)胞進(jìn) 行包裝，依靠細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖病毒。
[0005] 因此，從肥K293母本細(xì)胞株中篩選獲得重組腺病毒rAdV-SFV-E2株高適應(yīng)性的 肥K293克隆細(xì)胞株，對(duì)豬攝基因工程疫苗開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)均具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是從肥K293母本細(xì)胞株中克隆得到能夠高效培養(yǎng)重 組腺病毒rAdV-SFV-E2株并顯著提高病毒滴度的肥K293克隆細(xì)胞株。
[0007] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0008]本發(fā)明選擇種細(xì)胞肥K293,采用有限稀釋法進(jìn)行單細(xì)胞克隆，然后選取單個(gè)克 隆進(jìn)一步亞克隆，經(jīng)2次亞克隆，最終獲得4株單克隆細(xì)胞株，分別命名為肥K293-D9、 肥K293-B8、肥K293-D10 和肥K293-C4。
[0009] 本發(fā)明進(jìn)一步對(duì)肥K293克隆細(xì)胞株肥K293-D9、肥K293-B8、肥K293-D10和 肥K293-C4的形態(tài)和生長(zhǎng)特性進(jìn)一步研究，并分析其對(duì)重組腺病毒rAdV-SFV-E2株的適應(yīng) 性。
[0010] 生長(zhǎng)特性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單細(xì)胞克隆株肥K293-D9和肥K293-B8的生長(zhǎng)速度明顯 快于其它兩株細(xì)胞及母本細(xì)胞。
[0011] 用重組腺病毒rAdV-SFV-E2株感染單克隆細(xì)胞株4化后的病毒滴度測(cè)定發(fā)現(xiàn)，單 克隆細(xì)胞株肥K293-D9和肥K293-B8的病毒滴度分別為l(f2和10 8'5TCID5e/mU顯著高出 肥K293-D10和肥K293-C4的病毒滴度。
[0012] 單克隆細(xì)胞對(duì)重組腺病毒rAdV-SFV-E2株的適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單克隆細(xì)胞株 肥K293-D9和肥K293-B8的適應(yīng)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于肥K293-D10和肥K293-C4。
[0013] 綜上所述，單克隆細(xì)胞株肥K293-D9和肥K293-B8在生長(zhǎng)速度、病毒的適應(yīng)性及 穩(wěn)定性等各方面的性能遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于其它的肥K293單克隆細(xì)胞株；因此，本發(fā)明將兩株性能優(yōu) 異的、重組腺病毒rAdV-SFV-E2株高適應(yīng)性的克隆細(xì)胞株肥K293-D9及肥K293-B8提交至 專(zhuān)利認(rèn)可的機(jī)構(gòu)進(jìn)行保藏；其中，肥K293單克隆細(xì)胞株肥K293-D9的微生物保藏編號(hào)為： CGMCCNo. 11097 ;分類(lèi)命名是：人胚胎腎細(xì)胞肥K293 ;保藏時(shí)間是：2015年8月12日；保藏 單位是：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、；保藏地址是：北京市朝陽(yáng)區(qū)北 辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
[0014] 肥K293單克隆細(xì)胞株肥K293-B8的微生物保藏編號(hào)為：CGMCCNo. 11096;分類(lèi)命 名是：人胚胎腎細(xì)胞肥K293;保藏時(shí)間是：2015年8月12日；保藏單位是：中國(guó)微生物菌種 保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、；保藏地址是：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科 學(xué)院微生物研究所。
[0015] 本發(fā)明所提供的兩株性能優(yōu)異的、重組腺病毒rAdV-SFV-E2株高適應(yīng)性的肥K293 克隆細(xì)胞株肥K293-D9和肥K293-B8能夠高效增殖病毒，顯著提高病毒滴度，在重組腺病毒 rAdV-SFV-E2株的生產(chǎn)中應(yīng)用潛力尤為巨大。
[0016] 由此，本發(fā)明公開(kāi)了所述應(yīng)用所述肥K293克隆細(xì)胞株肥K293-D9和肥K293-B8在 培養(yǎng)病毒中的應(yīng)用，包括W下步驟：
[0017] (1)培養(yǎng)權(quán)利要求1或2所述的肥K293克隆細(xì)胞株至單細(xì)胞層；（2)接種病毒株 進(jìn)行培養(yǎng)；（3)收獲病毒液。
[0018] 本發(fā)明進(jìn)一步考察了應(yīng)用肥K293克隆細(xì)胞株肥K293-D9培養(yǎng)重組腺病毒疫苗株 的各項(xiàng)參數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在病毒接種劑量、收獲病毒液的時(shí)間W及病毒株的吸附時(shí)間等 參數(shù)對(duì)于病毒液的效價(jià)均能產(chǎn)生顯著的影響。
[0019] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，在接種病毒rAdV-SFV-E2株時(shí)，按照接種劑量MOI= 0. 1加入病毒， 能獲得較高效價(jià)的病毒液，其效價(jià)最高達(dá)到108'5±°'2TCID日。/mL;按照接種劑量MOI= 0. 1加 入病毒時(shí)，在病毒感染后24~3化收獲病毒液，其效價(jià)達(dá)到最高~1〇s'4±°'2TCIDw/ mL)，其中，在病毒感染后3化收獲病毒液，其效價(jià)達(dá)到最高（l(f4±°'2TCIDw/mL)，超過(guò)3化收 獲病毒液，效價(jià)呈急驟下降態(tài)勢(shì)。
[0020] 按照MOI= 0. 1接種病毒，吸附0. 5-比后補(bǔ)加病毒維持液，能夠明顯提升病毒滴 度，其中，吸附Ih后再補(bǔ)加病毒維持液，病毒效價(jià)達(dá)到最高（l〇s'6±°'2TCIDw/mL);為了有效 提升病毒液的滴度，本發(fā)明優(yōu)選在接種病毒后吸附Ih后補(bǔ)加病毒維持液，再繼續(xù)進(jìn)行培 養(yǎng)。
[0021] 本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，無(wú)血清的病毒維持液與含1%牛血清的病毒維持液無(wú)顯 著差異，考慮成本，因此本發(fā)明優(yōu)選采用無(wú)血清的病毒維持液。
[0022] 所述的病毒包括腺病毒（Adenovirus)或慢病毒化entivirus);優(yōu)選的，所述腺病 毒包括重組腺病毒或其他血清型腺病毒；所述重組腺病毒為重組5型人腺病毒；所述病毒 株為重組腺病毒株，優(yōu)選為重組腺病毒rAdV-SFV-E2株。
[0023] 本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有W下有益效果：
[0024] 本發(fā)明從肥K293母本細(xì)胞株中克隆得到了 2株性能優(yōu)異的肥K293克隆細(xì)胞株 肥K293-D9和肥K293-B8,重組腺病毒rAdV-SFV-E2株在兩株細(xì)胞克隆株中能夠高效增殖， 并獲得較高效價(jià)的病毒液，其毒價(jià)不低于l〇8'°TCIDw/mU與肥K293母本細(xì)胞培養(yǎng)的病毒相 比，病毒滴度提高了 10倍左右，在豬攝基因工程疫苗的生產(chǎn)中有較高的應(yīng)用價(jià)值。
[00巧]本發(fā)巧所徙及到的術(shù)語(yǔ)定女
[0026] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。
[0027] 術(shù)語(yǔ)"單細(xì)胞克隆"意指將一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使之不斷分裂，形成一個(gè)細(xì)胞群的 過(guò)程，運(yùn)一群細(xì)胞來(lái)源于一個(gè)共同的祖先細(xì)胞。
[0028] 術(shù)語(yǔ)"亞克隆"意指在細(xì)胞克隆中，對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞，從原有的克隆中再篩選出具有 某種特性的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。
[0029] 術(shù)語(yǔ)"傳代"意指當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要分離出一部分細(xì)胞和更新?tīng)I(yíng) 養(yǎng)液的過(guò)程，否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存。
【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1四株單克隆細(xì)胞株的細(xì)胞形態(tài)：其中，A:肥K293-D10 ;B出EK293-C4;C: 肥K293-D9;D:肥K293-B8 ;
[0031] 圖2肥K293單克隆細(xì)胞株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果；
[0032] 圖3單克隆細(xì)胞對(duì)重組腺病毒rAdV-SFV-E2株的適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（*p<0. 05)。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可W對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié) 和形式進(jìn)行修改或替換，但運(yùn)些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0034] 1、實(shí)驗(yàn)材料
[0035] 毒株：重組腺病毒載體豬攝基因工程疫苗rAdV-SFV-E2株，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈 爾濱獸醫(yī)研究所豬烈性傳染病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)構(gòu)建、鑒定和保存。肥K293細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)菌種保藏 中屯、（ATCC)。
[0036] 實(shí)施例1肥K293克隆細(xì)胞株的克隆及鑒定
[0037] 1實(shí)驗(yàn)方法
[0038] 1. 1肥K293克隆細(xì)胞株的克隆
[0039] (I)選擇種細(xì)胞肥K293;
[0040] 似細(xì)胞傳代：首先復(fù)蘇步驟（1)所選擇的種細(xì)胞到T25(Corning)的細(xì)胞瓶中， 培養(yǎng)3化左右，按照1:4的比例進(jìn)行傳代，克隆前連續(xù)傳代10次；
[0041] (3)采用有限稀釋法在96孔板內(nèi)進(jìn)行肥K293單細(xì)胞克隆，消化后的肥K293細(xì)胞 計(jì)數(shù)后稀釋到1個(gè)細(xì)胞/mU將稀釋好的細(xì)胞鋪于96孔板，0.ImL/孔，37°C5%C〇2培養(yǎng)箱 內(nèi)培養(yǎng)，觀察10日；
[0042] (4)選取單個(gè)克隆進(jìn)一步亞克隆，經(jīng)2次亞克隆，選取單克隆株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培 養(yǎng)液為DMEM(含10%FB巧，并對(duì)克隆細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。
[0043]