一種提高精子運動速度的試劑及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生殖醫(yī)學技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，設(shè)及一種提高精子運動速度的試劑及 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 雖然人類的睪丸可W利用生精干細胞產(chǎn)生數(shù)億條乃至無限數(shù)量的精子，每一次射 精也會射出上百萬的精子，可是，運些精子并不是完全相同的。精子間差異表現(xiàn)在精子外包 被的附睪蛋白質(zhì)差異、細胞核DNA的完整性、線粒體DNA(mtDNA)數(shù)量與突變、細胞膜脂類與 糖基的分布、頂體結(jié)構(gòu)完整性等諸多方面。在體內(nèi)，能夠到達受精位置（輸卵管壺腹部）的 精子數(shù)目只有20~200條左右，只有運一類精子才能最終使卵母細胞受精，而其他大多數(shù) 精子的功能在于免疫抑制作用。受精精子具有怎樣的分子組成與標記，目前還不清楚。目 前輔助生殖技術(shù)中使用的精子分離方法主要是密度梯度離屯、和上游法。使用上游法，可W 提高精子的運動速度，使精子獲能，滿足正常的體外受精（IV巧要求。
[0003] 輔助生殖技術(shù)指采用醫(yī)療輔助手段使不育夫婦妊娠的技術(shù)，包括人工授精和體外 受精-胚胎移植及其衍生技術(shù)兩大類。試管嬰兒就是使用該技術(shù)的體外受精-胚胎移植方 法生育的嬰兒。輔助生殖技術(shù)使不育夫婦實現(xiàn)妊娠生子的愿望，由不育引發(fā)的相關(guān)問題自 然會隨之得到解決，其還是遏止遺傳病的傳遞，實現(xiàn)優(yōu)生的重要手段。因此研發(fā)提高精子運 動速度的相關(guān)試劑和方法，可改進體外受精方法，為提高試管嬰兒的質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。
[0004] 此外，受精的過程和原理一直是生殖醫(yī)學中備受關(guān)注的研究課題，研究受精精子 的特點對于促進生殖醫(yī)學的理論發(fā)展具有重要意義。
[0005] 然而，目前還未見提高精子運動速度W提高精子受精能力的相關(guān)試劑和方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種提高精子運動速度的試劑。
[0007] 本發(fā)明的再一的目的是，提供所述試劑的用途。
[0008] 本發(fā)明的另一的目的是，提供一種提高精子運動速度的方法。
[0009] 為實現(xiàn)上述第一個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0010] 一種提高精子運動速度的試劑，所述的試劑由W下組分組成：孕酬、N6-Monobutyr yladenosine-3'，5'-cyclicmonophosphate和CalciumIonophoreA23187,S者濃度t：t依 次為（10-100yg/ml) : (I-IOmM) : (I-IOmM)。 1] 優(yōu)選地，所述的試劑中；者濃度比依次為巧0-70yg/mU: (4-6mM) : (4-6mM)。 陽01引更優(yōu)選地，所述的試劑中S者濃度比依次為（60Jig/ml):巧ml):巧ml)。
[0013] 為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0014] 如上任一所述的試劑在制備提高精子運動速度的試劑中的應(yīng)用。
[0015] 如上任一所述的試劑在制備提高體外受精率或胚胎質(zhì)量的藥物中的應(yīng)用。
[0016] 為實現(xiàn)上述第=個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0017] 一種提高精子運動速度的方法，包括W下步驟：
[0018] a)將精子培養(yǎng)液平鋪在液化的精液樣本之上，上游0. 8-1. 2小時，然后抽取最上 端為所述精子培養(yǎng)液0. 5-0. 9倍體積的液體，得到獲能精子；
[0019] b)向無菌麥管內(nèi)注滿精子培養(yǎng)液，并于頂部添加如上任一所述的提高精子運動速 度的試劑，然后將所述無菌麥管的下端插到步驟a)得到的獲能精子的上部，上游0. 8-1. 2 小時，取出無菌麥管，收集所述無菌麥管上端3/5-4/5長度的液體；
[0020] 所述的精子培養(yǎng)液為添加10%人血清白蛋白的HTF培養(yǎng)液。
[0021] 優(yōu)選地，所述的方法包括W下步驟：
[0022] a)將精子培養(yǎng)液平鋪在液化的精液樣本之上，上游1小時，然后抽取最上端為所 述精子培養(yǎng)液0. 8倍體積的液體，得到獲能精子；
[0023] b)向無菌麥管內(nèi)注滿精子培養(yǎng)液，并于頂部添加如上任一所述的提高精子運動速 度的試劑，然后將所述無菌麥管的下端插到步驟a)得到的獲能精子的上部，上游1小時，取 出無菌麥管，收集所述無菌麥管上端4/5長度的液體。
[0024] 本發(fā)明優(yōu)點在于：
[0025] 1、本發(fā)明提供了一種能顯著提高精子運動速度的試劑，該試劑能夠顯著提高精子 活力，使之更符合受精精子的特點。
[00%] 2、本發(fā)明使用上游法獲得獲能精子，然后使用線粒體激活劑誘導上游法獲得超激 活運動狀態(tài)的精子，獲得的精子不僅在活動能力上超過獲能精子，而且產(chǎn)生的ROS少，精子 相對線粒體活性提高，運樣的精子更符合受精精子的特點。
[0027] 本發(fā)明為改進體外受精方法，提高試管嬰兒的質(zhì)量提供了理論基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0028] 圖1.JC-I染色圖片。同一條精子中，同時含有高能和低能線粒體。圖C、F顯示未 染色精子形態(tài)，圖A、D顯示紅色高膜電位線粒體，圖B、E顯示綠色低膜電位線粒體。 W29] 圖2.DCF染色圖片。A:R0S特異性染色劑DCF顯示，ROS陽性部分（綠色）分布在 精子的頭、頸、尾各部分。B:未染色精子。
【具體實施方式】
[0030] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細說明。 陽0川 實施例1
[0032] 1.對象與方法
[0033]1. 1精液樣本選擇
[0034] 根據(jù)《世界衛(wèi)生組織人類精液分析實驗室技術(shù)手冊》第五版標準及通過病史詢問、 體格檢查、精液的病原學檢查等，選取精液參數(shù)在正常范圍，并排除前列腺炎、精索靜脈曲 張等相關(guān)疾病的樣本。選取精液樣本20份，年齡范圍在30. 8 + 3. 11歲。
[0035]1. 2精液樣本處理和實驗分組
[0036] 精子培養(yǎng)液為添加10 %人血清白蛋白的HTF培養(yǎng)液（HTF購于化igio公司，商品 號為：ART-1020)。精液液化后，直接使用精子培養(yǎng)液稀釋后，為獲能前組。上游法使用精 子培養(yǎng)液1毫升，平鋪在液化的精液樣本之上，上游1小時。抽取最上端的大約0. 8毫升液 體，運時收集的精子為獲能精子，為獲能后組。使用大約5厘米高的無菌麥管，一端封閉，并 注滿精子培養(yǎng)液，在麥管頂部添加/不添加60微升精子趨化試劑線粒體激活劑，將其插到 獲能精子樣本的上部，再上游1小時。取出麥管，去掉下端1厘米高度的精子培養(yǎng)液，收集 上游1-4厘米高的精子，獲得線粒體激活劑誘導精子，為線粒體激活劑誘導組和對照組。
[0037] 其中，所用的線粒體激活劑配方為：
[0038]
[0039]
[0040] 所述的Nb-Monobuty;ryladenosine-3'
，5'-cyclicmono地OS地ate(6-MB-cAMP) Cat.No.:M003,CASNo. : [70253-67-7];所述的CalciumIonophoreA23187CAS No. : [52665-69-7]。
[0041] I. 3JC-1 和DCF染色法
[0042] 將精液樣本用Hepes-bufferedHTF培養(yǎng)液洗涂2次后離屯、巧00Xg，5min)。去上 清，得到的精子沉淀用Iml胎pes-bufferedHTF培養(yǎng)液重懸，加入終濃度為50ng/ml的四 氯四乙基苯并咪挫基幾花青艦化物（JC-I)或二氯巧光黃值C巧染料。室溫避光解育15min， 離屯、去染色液，沉淀用預(yù)熱的化pes-bufferedHTF培養(yǎng)液清洗一次去除多余染料，最后加 入一定量的IXPBS使精子濃度在IXioVml左右，流式檢