一種纖維二糖水解酶突變體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶基因工程改造技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種纖維二糖水解酶突變體及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素酶（Cellulases)是水解纖維素（0-1，4葡聚糖或者P-D-糖巧鍵）導(dǎo)致 形成葡萄糖、纖維二糖、纖維寡糖（cellooligosaccharides)和類似物質(zhì)的酶。纖維素酶在 傳統(tǒng)上已被分為S個(gè)主要類型：內(nèi)切葡聚糖酶（endoglucanases，EC3. 2. 1. 4)，外切葡聚 糖酶（exoglucanases)或者纖維二糖水解酶（cellobiohy化olase，EC3. 2. 1.91)和 0-葡 萄糖巧酶（P-D-glucosideglucohy化olase，EC3. 2. 1.21)。內(nèi)切葡聚糖酶主要作用于纖 維素纖維的非晶體部分，而外切葡聚糖酶纖維二糖水解酶是唯一可W作用于晶體纖維素的 酶組分。因此，纖維二糖水解酶在纖維素酶體系中的存在對(duì)于晶體纖維素的有效溶解是必 需的。
[0003] 纖維二糖水解酶由3個(gè)部分組成：具有催化活性的催化結(jié)構(gòu)域，作用為錯(cuò)定纖維 素的纖維素結(jié)合域W及連接運(yùn)兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的一段短膚。在水解纖維素過程中，纖維二糖水 解酶主要作用于纖維素線性分子非還原端，水解P-1，4-糖巧鍵，每次切下一個(gè)纖維二糖 分子，使結(jié)晶纖維素成為易溶解的非結(jié)晶纖維素。
[0004] 當(dāng)前經(jīng)濟(jì)過分依賴于石油、煤炭等化石燃料，其不可再生性導(dǎo)致資源逐漸枯竭，燃 燒產(chǎn)生的二氧化碳已造成氣候環(huán)境的日益惡化。尋找可再生的清潔能源成為各國科研人員 關(guān)注的焦點(diǎn)。其中生物質(zhì)能源因具有來源廣泛、價(jià)格低廉、再生性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，成為最具潛力 的能源物質(zhì)。生物乙醇是源于可再生物質(zhì)的重要能源之一。木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的 可再生資源，全球每年通過光合作用產(chǎn)生的植物約10000億噸，為避免與人爭糧，木質(zhì)纖維 素將成為生物乙醇生產(chǎn)最具潛力的原料。 陽〇化]木質(zhì)纖維素?zé)捴粕镆掖歼^程通常包括預(yù)處理、水解、發(fā)酵、蒸饋等單元操作，其 中纖維素水解為可發(fā)酵糖是纖維素乙醇煉制過程中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。目前，木質(zhì)纖維素的 降解主要有化學(xué)法和酶法水解。與化學(xué)法水解相比，酶法水解工藝條件溫和，設(shè)備簡單，能 耗低，同時(shí)具有副產(chǎn)物少、環(huán)境友好等特點(diǎn)，受到廣泛重視并取得重大進(jìn)展。
[0006] 由于木質(zhì)纖維素中的纖維素主要W結(jié)晶狀態(tài)存在，因此纖維二糖水解酶在木質(zhì)纖 維素水解中的作用相當(dāng)重要。但目前現(xiàn)有的纖維二糖水解酶活力低，耗酶量大，發(fā)酵成本 高，且其在酸性條件下的酶解效率和轉(zhuǎn)化率普遍偏低，嚴(yán)重限制了木質(zhì)纖維素在生物乙醇 生產(chǎn)中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種纖維二糖水解酶變體及其應(yīng)用。本發(fā)明通過對(duì)纖維二糖 水解酶進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造，獲得了突變體蛋白。所述突變體在酸性條件下的酶活力得到 顯著提高，且耐熱性更強(qiáng)，能大大提高木質(zhì)纖維素的降解效率，進(jìn)而促進(jìn)其在生物乙醇生產(chǎn) 中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明一方面提供了一種纖維二糖水解酶突變體，是氨基酸序列為SEQIDNO:1 的纖維二糖水解酶第158位氨基酸由Asp變?yōu)锳sn,第298位氨基酸由Asp變?yōu)镾er，第434 位氨基酸由Glu變?yōu)閂al。
[0009] 上述纖維二糖水解酶突變體的氨基酸序列為SEQIDNO:3,其編碼基因的核酸序 列為沈QIDNO:4。
[0010] 本發(fā)明另一方面提供了一種重組質(zhì)粒，其攜帶有編碼序列為SEQIDNO:4的纖維 二糖水解酶突變體的基因。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種重組菌株，是通過將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入里氏木霉 (Trichodermareesei)中獲得的。
[0012] 本發(fā)明還提供了上述纖維二糖水解酶突變體在生物乙醇生產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明提供的纖維二糖水解酶突變體比野生型的耐酸性更強(qiáng)，其最適抑為5. 0， 且在抑3. 5-7. 0范圍內(nèi)均能保持65%W上的酶活水平，而野生型的最適抑為5. 5。所述纖 維二糖水解酶突變體可廣泛應(yīng)用于木質(zhì)纖維素的降解，能顯著提高木質(zhì)纖維素的糖化率。 其中，添加本發(fā)明所述纖維二糖水解酶突變體MAF6A的實(shí)驗(yàn)組2中木質(zhì)纖維素的糖化率比 對(duì)照組提高了 6. 5%，比添加野生型纖維二糖水解酶AF6A的實(shí)驗(yàn)組1提高了 3. 5%，取得了 意料不到的技術(shù)效果。
【附圖說明】
[0014] 圖1 :為重組菌株發(fā)酵上清液SDS-PAGE電泳檢測分析圖，其中，泳道1為里氏木霉 工程菌AF6A發(fā)酵上清液，泳道2為里氏木霉工程菌MAF6A發(fā)酵上清液，泳道3為對(duì)照組宿 主菌里氏木霉SCHD4發(fā)酵上清液，泳道1和2中箭頭所指SOkDa處的蛋白條帶分別為重組 表達(dá)的纖維二糖水解酶AF6A和突變體MAF6A;
[0015] 圖2:為纖維二糖水解酶突變體與野生型抑-相對(duì)酶活曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 本發(fā)明用到了遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)和方法，例如 MOLECULARCLONING=ALABORATORYMANUAL, 3ndEd. (Sambrook,2001)和CURRENT PROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(Ausubel, 2003)中所記載的方法。運(yùn)些一般性參考文獻(xiàn) 提供了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的定義和方法。但是本發(fā)明不限定于所述的任何具體方法、實(shí) 驗(yàn)方案和試劑。
[0017] 下面結(jié)合具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0018] 實(shí)施例1 :纖維二糖水解酶突變體基因的篩選
[0019] 為了提高野生型纖維二糖水解酶AF6A(氨基酸序列為SEQIDNO: 1，編碼核巧酸序 列為SEQIDNO:2,由上海生工生物工程股份有限公司合成）在酸性條件下的酶活力，通過 定向進(jìn)化技術(shù)對(duì)該酶進(jìn)行了大量突變的篩選，設(shè)計(jì)PCR引物AF6A-FUAF6A-R1如下：
[0020] AF6A-F1 ：GGCGAATTCATGAAGCACCTTGCATCTTCC(下劃線為限制性內(nèi)切酶EcoRI識(shí) 別位點(diǎn)）；
[0021] AF6A-R1:ATAGCGGCCGCTTAAAAGGACGGGTTAGCGTTGG(下戈 1|線為限制忡內(nèi)切酶NotI 識(shí)別位點(diǎn)）。 W22] W野生型纖維二糖水解酶AF6A基因SEQ ID N0:2為模板，利用上述引物用GeneMo巧h II隨機(jī)突變PCR試劑盒（Stratagene)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，膠回收PCR產(chǎn)物，EcoR I、 Not I進(jìn)行酶切處理后與經(jīng)同樣酶切后的祀T21a載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌化2UDE3)中， 涂布于LB+Amp平板，37°C倒置培養(yǎng)，待轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)后，用牙簽逐個(gè)挑至96孔板，每個(gè)孔中加 入150 y L含有0.1 mM IPTG的LB+Amp培養(yǎng)基，37°C，220巧m培養(yǎng)化左右，離屯、棄上清，菌體 用緩沖液重懸，反復(fù)凍融破壁，獲得含有纖維二糖水解酶的大腸桿菌細(xì)胞裂解液。 柳2引各取50yL裂解液至兩塊新的96孔板，分別在抑6.0和抑4.0的條件下測定其纖 維二糖水解酶酶活。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有些突變子在酸性條件的酶活沒有變化，有些突變子的酶活 甚至降低了，對(duì)在抑4. 0條件下依然保持高酶活的突變子進(jìn)行DNA測序，最終，申請(qǐng)人獲得 了能顯著提高纖維二糖水解酶酸性耐受性的突變位點(diǎn)組合D158N、D298S和E434V。
[0024]將含D158N、D298S和E434V突變位點(diǎn)的纖維二糖水解酶突變體命名為MAF6A，其 氨基酸序列為SEQIDNO:3,編碼核巧酸序列為SEQIDNO:4。SEQIDNO:4由上海生工生 物工程股份有限公司合成，并且在合成序列5'和3'兩端分別加上化nl和甜al兩個(gè)酶切 位點(diǎn)。 陽025] 將合成后的基因片段用限制性內(nèi)切酶化nl和甜al(Fermentas)進(jìn)行酶切；同時(shí)， 用限制性內(nèi)切酶化nl和XbaI對(duì)載體pTG進(jìn)行酶切；凝膠回收目的基因片段和載體；并用T4DNA連接酶將上述兩片段連接，轉(zhuǎn)化Tran巧a大腸桿菌，用氨節(jié)青霉素進(jìn)行篩選。為確 保準(zhǔn)確，對(duì)若干克隆進(jìn)行測序（Invitrogen)。 陽0%] 使用質(zhì)粒中量制備試劑盒（Axygen)從測序結(jié)果正確的大腸桿菌克隆中純化質(zhì) 粒，將攜帶纖維二糖水解酶突變體基因序列的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為PTG-MAF6A。
[0027] 實(shí)施例2:纖維二糖水解酶突變體重組菌株的構(gòu)建及驗(yàn)證
[0028] (1)原生質(zhì)體制備
[0029] 取里氏木霉燈richodermareesei)SCHD4菌株抱子懸液，接種于PDA平板上，30°C 培養(yǎng)6天；待其產(chǎn)抱豐富后，切取約IcmXlcm的菌落置于含120血YEG+lKO. 5%酵母粉、1% 葡萄糖、0. 1%尿巧）的液體培養(yǎng)基中，30°C，220rpm振蕩培養(yǎng)14~16h;
[0030] 用無菌紗布過濾收集菌絲體，并用無菌水清洗一次；將菌絲體置于含有20mL lOmg/mL裂解酶液（SigmaL1412)的S角瓶中，30°C，9化pm作用1-化；用顯微鏡觀察檢測 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化進(jìn)展；
[0031] 將預(yù)冷的20mL1. 2M山梨醇（1. 2M山梨醇，50mMTris-Cl，50mMCaClz)加入上述 S角瓶中，輕輕搖勻，用無菌Miracloth濾布過濾收集濾液，300化pm，4°C離屯、IOmin;棄上 清，加入預(yù)冷的5血1. 2M山梨醇溶液懸浮菌體，300化pm，4°C離屯、IOmin;棄上清，加入適量 預(yù)冷的1. 2M山梨醇懸浮分裝（200yL/管，原生質(zhì)體濃度為IO8個(gè)/mL)。
[0032] (2)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化與菌株驗(yàn)證
[0033]W下操作均在冰上進(jìn)行，取10yg重組質(zhì)粒PTG-MAF6A加入到含有200yL原生 質(zhì)體溶液的7血無菌