赤芝萜類合酶GL-TS2編碼基因cDNA序列及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說，設及赤芝祗類合酶化-TS2編碼基因CDNA序 列及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 靈芝為擔子菌綱度asidiomycetes)，多孔菌科（Polyproraceae)靈芝屬 (Ganoderma)真菌赤芝（GanodermaIucidum)和紫芝（G.sinense)的總稱。靈芝作為我國 傳統(tǒng)的藥用真菌，幾千年來一直被用于疾病治療和養(yǎng)生保健，具有悠久的藥用歷史。對于靈 芝的藥用記載最早出現(xiàn)在兩千多年前的《神農(nóng)本草經(jīng)》中，目前靈芝已被《美國草藥藥典與 治療綱要》（AmericanHerbalPharmacopoeiaandTherapeuticCompendium)收錄，其藥 用價值已得到世界各國的廣泛認可。靈芝中含有多種生物活性物質(zhì)，截止目前，已有400多 種不同的化合物被鑒定出來，包括150余種祗類化合物、靈芝多糖、蛋白質(zhì)、生物堿、氨基酸 等，因此靈芝又被稱為"生物活性成分細胞工廠"?，F(xiàn)代藥理學研究已經(jīng)證明，靈芝具有多種 重要的醫(yī)學價值，例如抗腫瘤、降血壓、抗病毒W(wǎng)及增強免疫能力等，其在疾病治療、新藥研 發(fā)等領(lǐng)域中具有廣闊的應用前景。
[0003] 靈芝祗類與靈芝多糖是靈芝藥用活性成分的主要組成部分。靈芝祗類中主要活性 成分是靈芝=祗，其他祗類如單祗、倍半祗W及二祗也具有較強的藥理活性。運=類祗在靈 芝中的含量極少，并且提取分離困難，化學合成亦面臨著巨大挑戰(zhàn)。同位素標記實驗顯示： 靈芝祗類通過甲徑戊酸途徑（MevalonicAcidPathway，MVP)合成，羊毛醬醇是祗類化合物 和麥角醬醇（真菌細胞膜的重要組分）的共同環(huán)狀前體，但是目前對于靈芝祗類下游特異 性合成途徑的研究還是空白，對于從單一前體羊毛醬醇形成種類繁多的靈芝祗類的分子機 制還不清楚。靈芝祗類生物合成途徑相當復雜，參與其中的關(guān)鍵酶、限速酶亦數(shù)目繁多。
[0004] 近年來，研究人員已經(jīng)展開了對靈芝祗類合成的MVP途徑中關(guān)鍵酶基因的克隆及 特征描述等相關(guān)研究，并取得了顯著的進展?；痭gmeiLuo等構(gòu)建了靈芝子實體CDNA文庫， 并對其做表達序列標簽巧xpressedSequence化g，EST)分析。研究人員從文庫中隨機抽 取了 1023個克隆，最終獲得879條高質(zhì)量的ESTs,經(jīng)序列比對后發(fā)現(xiàn)運些ESTs與多種已 知功能的基因具有極高的相似度，其中包括編碼整締環(huán)氧酶（S巧W及法呢基焦憐酸合成 酶（FPPS)的基因。化an曲Ua化ang等從靈芝中分離得到了編碼3-徑基-3-甲基戊二酸 輔酶A還原酶（HMGR)的基因，并獲得了其CDNA全長化及基因組序列全長。HMGR編碼基因 的cDNA序列（GenBank編號：EU263989)中開放閱讀框（OpenReadingRrame, 0RF)全長為 368化P，編碼一條包含1226個氨基酸的多膚鏈；HMGR編碼基因的DNA序列（GenBank編號： EU263990)全長為4262bp，包含7個外顯子和6個內(nèi)含子。此外，DingYX等W及ZhaoMW 等則分別從靈芝中克隆得到了法呢基焦憐酸合成酶（FPP巧編碼基因的CDNA序列全長W及 整締合成酶（SQ巧編碼基因的CDNA序列全長和基因序列全長。運些基因的獲得對后續(xù)進 行靈芝祗類生物合成途徑的異源構(gòu)建及表達等相關(guān)研究提供了極其寶貴的數(shù)據(jù)和資料。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽0化]本發(fā)明的目的是提供赤芝祗類合酶化-TS2編碼基因CDNA序列及其應用。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的赤芝祗類合酶化-TS2,其為： 陽007] 1)由SeqIDNo. 1所示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白；或
[0008] 2)SeqIDNo. 1所示氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且同等 功能的由1)衍生的蛋白。
[0009] 本發(fā)明還提供所述赤芝祗類合酶化-TS2的編碼基因。
[0010] 本發(fā)明還提供所述赤芝祗類合酶化-TS2編碼基因CDNA序列，其為：
[0011] i)SeqIDNo. 2所示的核巧酸序列；或
[0012] ii)SeqIDNo. 2所示的核巧酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個核巧酸且 表達相同功能蛋白質(zhì)的核巧酸序列；或
[0013] iii)在嚴格條件下與SeqIDNo. 2所示序列雜交的核巧酸序列；
[0014] 所述嚴格條件為在含0. 1 %SDS的0. 1XSS陽或含0. 1 %SDS的0. 1XSSC溶液中， 在65°C下雜交，并用該溶液洗膜。
[0015] 本發(fā)明還提供含所述赤芝祗類合酶化-TS2編碼基因或所述赤芝祗類合酶化-TS2 編碼基因CDNA序列的載體。
[0016] 本發(fā)明還提供含所述赤芝祗類合酶化-TS2編碼基因或所述赤芝祗類合酶化-TS2 編碼基因CDNA序列的宿主細胞、工程菌及轉(zhuǎn)基因細胞系。
[0017] 本發(fā)明還提供所述赤芝祗類合酶化-TS2編碼基因或所述赤芝祗類合酶化-TS2編 碼基因CDNA序列在調(diào)控真菌及植物祗類化合物合成中的應用。
[0018] 本發(fā)明還提供所述赤芝祗類合酶化-TS2編碼基因或所述赤芝祗類合酶化-TS2編 碼基因CDNA序列在調(diào)控祗類化合物體外合成中的應用。
[0019] 所述應用是W大腸桿菌內(nèi)源性FPP(法尼基焦憐酸）為底物，通過轉(zhuǎn)化赤芝祗類合 酶化-TS2的編碼基因或其CDNA序列，實現(xiàn)在大腸桿菌內(nèi)異源合成祗類化合物（倍半祗）。
[0020] 本發(fā)明還提供用于PCR擴增所述赤芝祗類合酶化-TS2編碼基因CDNA序列的特異 性引物對，包括：
[0021] 正向引物：5' -GCCTCCCTCACCCACTCCAT-3'
[0022] 反向引物：5' -GCGAGGACCACCTAAACCC-3'
[0023] 本發(fā)明利用同源序列捜索和結(jié)構(gòu)域捜索的方法，根據(jù)靈芝基因組（GenBank編號： AGAX00000000. 1)公開的序列信息，，獲得候選祗類合酶基因CDNA序列，使用引物設計軟件 LasergenePrimerSelect對該基因序列進行分析，在其開放閱讀框（ORF)前后10化P的范 圍內(nèi)尋找最適引物對，最終確定引物序列為：
[0024] 正向引物：5' -GCCTCCCTCACCCACTCCAT-3' 陽0巧]反向引物：5' -GCGAGGACCACCTAAACCC-3'
[00%] 所述祗類合酶編碼基因CDNA克隆方法為：提取赤芝菌絲總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA， 利用上述引物對，W赤芝菌絲cDNA為模板進行PCR反應，回收PCR擴增產(chǎn)物與載體鏈接，轉(zhuǎn) 化大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆并測序。
[0027] 本發(fā)明提供的赤芝祗類合酶化-TS2的開放閱讀框（ORF)長度為104化P(SeqID No. 2)，編碼346個氨基酸（SeqIDNo. 1)。將化-TS2全長開放讀碼框用BLAST程序在 NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源性檢索，該基因在氨基酸水平上進行BLASP比對分析顯示，赤芝 化-TS2基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列與其它物種的同源性較高，其中與已進行功能驗證的 Dichomi1:ussqualensLYAD-421SS1(污叉絲孔菌）相似度最高，達 92%。
[0028] 祗類合酶基因是一類WGPP(彼牛兒基焦憐酸）、FPP(法尼基焦憐酸）和GGPP(彼 牛兒基彼牛兒基焦憐酸）為底物，分別催化單祗、倍半祗及二祗生物合成的一類酶家族成 員。本發(fā)明的赤芝祗類合酶化-TS2能夠催化上述祗類物質(zhì)的合成，通過W大腸桿菌內(nèi)源性 FPP為底物，轉(zhuǎn)化赤芝祗類合酶基因GkTS2,從而實現(xiàn)在大腸桿菌內(nèi)異源合成祗類化合物。
【附圖說明】
[0029] 圖1為本發(fā)明實施例2中化-TS2基因在赤芝不同組織部位（菌絲mycelia、原基 primordia、子實體fruitingbodies)的表達情況。
[0030] 圖2為本發(fā)明實施例3中重組質(zhì)粒祀T28a-GkTS2的PCR鑒定結(jié)果；其中，M為 DL2000DNAMaker, 1 為祀T28a-GkTS2 重組質(zhì)粒。
[0031] 圖3為本發(fā)明實施例3中酶促反應產(chǎn)物的GC-MS分析結(jié)果（色譜圖）。
[0032] 圖4、圖5、圖6、圖7、圖8、圖9、圖10、圖11、圖12、圖13和圖14為本發(fā)明實施例 3中酶促反應產(chǎn)物的GC-MS分析結(jié)果（質(zhì)譜圖）。
【具體實施方式】
[0033] W下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實 施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（SambrookJ&RussellDW， Molecularcloning:a1油oratorymanual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0034] 實施例1赤芝祗類合酶化-TS2編碼基因CDNA序列的獲得
[0035] 1、根據(jù)已經(jīng)測得的靈芝全基因組（GenBank編號：AGAX00000000. 1)數(shù)據(jù)，通過拼 接、注釋等操作，獲得候選祗類合酶基因CDNA序列。
[0036] 2、取生長旺盛的靈芝菌絲，使用QiaGenRNeasy?Mini試劑盒進行RNA的提 取，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PROMEGA)進行逆轉(zhuǎn)錄，對獲取的CDNA為模板，使用引物設計軟件 LasergenePrimerSelect對該候選基因cDNA序列進行分析，在其開放閱讀框（ORF)前后 IOObp的范圍內(nèi)尋找最適引物對，最終確定引物序列為：
[0037] 正向引物：5' -GCCTCCCTCACCCACTCCAT-3'
[0038] 反向引物：5' -GCGAGGACCACCTAAACCC-3'
[0039] 引物由北京S博遠志生物技術(shù)有限責任公司合成。
[0040] 3、瓊脂糖凝膠電泳表明約在1000 bp處出現(xiàn)特異片段，瓊脂糖凝膠回收試劑盒 (Takara)回收目標片段，克隆至pGEM-Teasy載體（Promega)中，鑒定陽性克隆并進行測序 驗證（北京農(nóng)業(yè)科學院測序中屯、），用于表達載體的構(gòu)建。
[0041] 實施例2化-TS2基因CDNA序列的生物信息學分析及組織表達分析
[0042] 1、本發(fā)明的赤芝祗類合酶化-TS2的開放閱讀框（ORF)長度為104化p(SeqID No. 2)，編碼346個氨基酸（SeqIDNo. 1)。將化-TS2全長開放讀碼框用BLAST程序在 NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源性檢索，該基因在氨基酸水平上進行BLASP比對分析顯示，赤芝 化-TS2基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列與其它物種的同源性較高，其中與已進行功能驗證的 Dichomi1:ussqualensLYAD-421SS1(污叉絲孔菌）相似度最高，達 92%。
[0043] 2、提取赤芝S個不同生長時期菌絲、原基和子實體的總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄 試劑盒（PROMEGA)進行逆轉(zhuǎn)錄，W蛋白憐酸酶2A(PP2A)基因為內(nèi)參基因，進行巧 光定量PCR分析，正向引物為：5 ' -ATGTCCAGGAGCGTCAAGTAT-3 '，反向引物為： 5' -GCGTTGAGCGTGAGGAAC-3'，結(jié)果表明該基因在子實體期的表達明顯高于其在菌絲期和 原基期的表達（圖1)。
[0044] 實施例3化-TS2基因CDNA序列的原核表達及功能分析
[0045] 1、根據(jù)赤芝祗類合酶的全長CDNA序列，設計PCR擴增完整開放閱讀框的引物，分 別在正、反向引物上加入限制性酶切位點NdeI和化ndlll。所設計的引物為：
[0046] 正向引物：5' -CGCCATATGATGCCTGCA-3'
[0047] 反向引物：5' -CCCAAGCTTCTAGGCATG-3'
[0048] W全長CDNA片段為模板，經(jīng)PCR擴增后，保證赤芝祗類合酶基因的閱讀框完全正 確，并用NdeI和HindIII內(nèi)切酶進行酶切反應，回收目的片段104化P;大腸桿菌表達載體 祀T28a用NdeI和Hind