真空干燥，得固定化木聚糖酶；
[0067](3)對(duì)步驟(2)制備得到的細(xì)菌纖維素/殼聚糖復(fù)合微球固定化木聚糖酶的酶活力、酶活力回收率進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得細(xì)菌纖維素/殼聚糖復(fù)合微球固定化木聚糖酶的相對(duì)酶活力為79%，酶活力回收率為74%，連續(xù)使用5次后，酶活力仍保持82%。
[0068]實(shí)施例5
[0069]本實(shí)施例的一種木聚糖酶的固定化方法，以細(xì)菌纖維素/殼聚糖復(fù)合微球?yàn)楣潭ɑd體，包括固定化載體的制備和固定化木聚糖酶的制備，步驟如下:
[0070](I)固定化載體的制備:
[0071]a.種子培養(yǎng):將購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心的木醋桿菌CGMCCN0.1.1812斜面種子接入裝有10ml HS種子培養(yǎng)液中，在30°C下轉(zhuǎn)速為160rpm下振蕩培養(yǎng)24h，得到種子培養(yǎng)液；
[0072]b.細(xì)菌纖維素的制備:以8% (v/v)的接種量接入裝有HS發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，30°C下在培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2d，形成細(xì)菌纖維素凝膠，用0.lmol/1的NaOH溶液煮沸處理6h后，用蒸餾水清洗至細(xì)菌纖維素凝膠的pH為7.0，將該細(xì)菌纖維素凝膠在105°C下干燥至恒重，得到細(xì)菌纖維素干膜；
[0073]c.細(xì)菌纖維素的打漿:稱(chēng)取步驟b中制備的細(xì)菌纖維素干膜，細(xì)菌纖維干膜質(zhì)量與4%醋酸溶液的質(zhì)量/體積之比為1:40的比例置于打漿機(jī)中，轉(zhuǎn)速為300r/min，處理時(shí)間為15min，得到細(xì)菌纖維素混懸液；
[0074]d.細(xì)菌纖維素/殼聚糖微球的制備:稱(chēng)取殼聚糖4g，加入步驟c中制備的細(xì)菌纖維素混懸液100ml，用玻璃棒攪拌混合均勻，制備得到殼聚糖-細(xì)菌纖維素混合液。用1ml的注射器吸取混合液滴入4mol/L NaOH溶液中，充分反應(yīng)6h，用Tris-HCl緩沖液(pH 6.0)洗滌，離心，真空干燥，得到細(xì)菌纖維素/殼聚糖微球微球；
[0075](2)固定化木聚糖酶的制備:
[0076]a.稱(chēng)取步驟(I)制備的細(xì)菌纖維素/殼聚糖微球1.5g，加入0.5%戊二醛15ml，緩慢攪拌30min，室溫下靜置過(guò)夜，用PH為6.0的Tris-HCl緩沖液洗去多余的戊二醛，留沉淀，離心、真空干燥，得含交聯(lián)醛基的細(xì)菌纖維素/殼聚糖微球；
[0077]b.用PH為6.0的Tris-HCl緩沖液溶解木聚糖酶，得濃度為1.5mg/ml的木聚糖酶溶液，量取木聚糖酶溶液15ml，加入步驟a制備的含交聯(lián)醛基的細(xì)菌纖維素/殼聚糖微球1.5g，4°C交聯(lián)反應(yīng)12h，離心，沉淀，真空干燥，得固定化木聚糖酶；
[0078](3)對(duì)制備得到的細(xì)菌纖維素/殼聚糖復(fù)合微球固定化木聚糖酶的酶活力、酶活力回收率進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得細(xì)菌纖維素/殼聚糖復(fù)合微球固定化木聚糖酶相對(duì)酶活力達(dá)到80.3%，活力回收率達(dá)75.1%，連續(xù)使用5次后，酶活力仍保持83.2%。
[0079]以上所述僅為本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明創(chuàng)造，凡在本發(fā)明創(chuàng)造的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種木聚糖酶的固定化方法，其特征在于以細(xì)菌纖維素/殼聚糖復(fù)合微球?yàn)楣潭ɑd體，包括固定化載體的制備和固定化木聚糖酶的制備，其中固定化載體的制備包括種子培養(yǎng)、細(xì)菌纖維素的制備、細(xì)菌纖維素的打漿和細(xì)菌纖維素/殼聚糖復(fù)合微球的制備。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種木聚糖酶的固定化方法，其特征在于固定化載體的制備通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn): (1)種子培養(yǎng):取活化的木醋桿菌CGMCCN0.1.1812斜面種子，接入在HS培養(yǎng)基中，在30°C下，轉(zhuǎn)速為160r/min，振蕩培養(yǎng)24h ； (2)細(xì)菌纖維素的制備:細(xì)菌纖維素為膜式細(xì)菌纖維素或絮狀細(xì)菌纖維素，當(dāng)細(xì)菌纖維素為膜式細(xì)菌纖維素，則制備方法為:以2?10%的接種量接入HS發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C下培養(yǎng)2?6d，形成細(xì)菌纖維素凝膠，用0.lmol/1的NaOH溶液煮沸處理6h，用蒸餾水清洗至細(xì)菌纖維素凝膠的pH為7.0，將該細(xì)菌纖維素凝膠在105°C下干燥至恒重，得到細(xì)菌纖維素干膜；當(dāng)細(xì)菌纖維素為絮狀細(xì)菌纖維素，則制備方法為:以2?10%的接種量接入HS發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C下培養(yǎng)2?6d，形成細(xì)菌纖維素凝膠； (3)細(xì)菌纖維素的打漿:當(dāng)細(xì)菌纖維素為膜式細(xì)菌纖維素時(shí)，將步驟(2)中制備得到的細(xì)菌纖維素干膜與4%醋酸溶液置于打漿機(jī)中，細(xì)菌纖維素干膜的質(zhì)量與4%醋酸溶液的體積之比為1:40，轉(zhuǎn)速為300?1000r/min，時(shí)間5?15min，形成混懸液；當(dāng)細(xì)菌纖維素為絮狀細(xì)菌纖維素時(shí)，將步驟(2)中制備得到的細(xì)菌纖維素凝膠浸泡于0.lmol/1的NaOH溶液中，100°C煮沸6h，用蒸餾水或0.lmol/1的醋酸溶液沖洗，至pH值為7.0，將細(xì)菌纖維素凝膠與4%醋酸溶液置于打漿機(jī)中，其中細(xì)菌纖維素濕重與4%醋酸溶液的體積之比為1:4，轉(zhuǎn)速為300?1000r/min，時(shí)間5?15min，形成混懸液； (4)細(xì)菌纖維素/殼聚糖復(fù)合微球的制備:稱(chēng)取2?4g殼聚糖，加入步驟(3)中制備得到的細(xì)菌纖維素混懸液25?10ml，充分溶解得殼聚糖-細(xì)菌纖維素混合液，用注射器吸取混合液滴入4mol/L NaOH溶液中，充分反應(yīng)Ih以上，用PH值為6.0的Tris-HCl緩沖液洗滌，離心，真空干燥，備用。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種木聚糖酶的固定化方法，其特征在于固定化木聚糖酶的制備通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn): (1)稱(chēng)取細(xì)菌纖維素/殼聚糖復(fù)合微球I?2g，加入0.5%戊二醛10?20ml，緩慢攪拌30分鐘，室溫下靜置12小時(shí)，離心去上清液，用pH值為6.0的Tris-HCl緩沖液洗去多余的戊二醛，留沉淀，離心、真空干燥，得含交聯(lián)醛基的細(xì)菌纖維素/殼聚糖復(fù)合微球； (2)稱(chēng)取步驟(I)中得到的含交聯(lián)醛基的細(xì)菌纖維素/殼聚糖復(fù)合微球I?2g，加入10?20ml木聚糖酶溶液，攪拌均勻，4°C下交聯(lián)反應(yīng)12小時(shí)，離心，沉淀，真空干燥，得固定化木聚糖酶。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種木聚糖酶的固定化方法，其特征在于所述步驟(4)中細(xì)菌纖維素/殼聚糖復(fù)合微球的制備方法為:稱(chēng)取2?3g殼聚糖，加入步驟(3)中制備得到的細(xì)菌纖維素混懸液25?50ml，充分溶解得殼聚糖-細(xì)菌纖維素混合液，用注射器吸取混合液滴入4mol/L NaOH溶液中，充分反應(yīng)6h，用PH值為6.0的Tris-HCl緩沖液洗滌，離心，真空干燥，備用。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種木聚糖酶的固定化方法，其特征在于所述步驟(4)中細(xì)菌纖維素/殼聚糖復(fù)合微球的制備方法為:稱(chēng)取2g殼聚糖，加入步驟(3)中制備得到的細(xì)菌纖維素混懸液25ml，充分溶解得殼聚糖-細(xì)菌纖維素混合液，用注射器吸取混合液滴入4mol/L NaOH溶液中，充分反應(yīng)6h，用PH值為6.0的Tris-HCl緩沖液洗滌，離心，真空干燥，備用O6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種木聚糖酶的固定化方法，其特征在于所述步驟(2)為:稱(chēng)取步驟(I)中制備得到的含交聯(lián)醛基的細(xì)菌纖維素/殼聚糖復(fù)合微球1.5?2g，加入15?20ml木聚糖酶溶液，攪拌均勻，4°C下交聯(lián)反應(yīng)12小時(shí)，離心，沉淀，真空干燥，得固定化木聚糖酶。7.根據(jù)權(quán)利要求3或6任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的一種木聚糖酶的固定化方法，其特征在于步驟(2)中所述木聚糖酶的濃度為0.25?2.0mg/mlo8.一種固定化木聚糖酶，其特征在于以細(xì)菌纖維素/殼聚糖復(fù)合微球?yàn)楣潭ɑd體。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種木聚糖酶的固定化方法，包括固定化載體的制備和固定化木聚糖酶的制備，主要步驟包括細(xì)菌纖維素種子培養(yǎng)，細(xì)菌纖維素的制備，細(xì)菌纖維素的打漿，細(xì)菌纖維素/殼聚糖復(fù)合微球的制備；將細(xì)菌纖維素/殼聚糖微球和戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，將含交聯(lián)醛基的細(xì)菌纖維素/殼聚糖微球和木聚糖酶溶液在4℃下進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，離心，沉淀，真空干燥，得固定化木聚糖酶。本發(fā)明制備得到的固定化酶其活力回收率達(dá)75.3％，相對(duì)酶活力達(dá)到80.5％，該固定化酶連續(xù)使用5次后，酶活力保持83.6％，具有較好的穩(wěn)定性，該固定化酶具有較高的應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類(lèi)】C12N11/08, C12N11/12
【公開(kāi)號(hào)】CN105154426
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510575355
【發(fā)明人】湯衛(wèi)華, 殷海松, 魏紀(jì)平, 陳珊, 張樂(lè), 龍尾, 程秀瑋, 苑鵬, 黃艷玲, 高蘆寶, 閆雪冰
【申請(qǐng)人】天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院
【公開(kāi)日】2015年12月16日
【申請(qǐng)日】2015年9月10日