一種利用issr分子標(biāo)記技術(shù)建立不同產(chǎn)地花生黃曲霉菌dna指紋圖譜的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)建立不同產(chǎn)地花生黃曲霉菌DNA指紋圖譜的方法，屬于食品安全領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]黃曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)是一類主要由黃曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)等真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，在我國，黃曲霉毒素主要由黃曲霉菌產(chǎn)生。黃曲霉毒素具有致癌、致畸、致細(xì)胞突變的“三致”作用，僅0.294mg/kg劑量就能引起敏感動(dòng)物的急性中毒死亡，是誘發(fā)惡性腫瘤原發(fā)性肝細(xì)胞癌的主要因素之一，最短24周內(nèi)就能導(dǎo)致肝臟壞死癌變。
[0003]花生極易受到黃曲霉菌侵染，侵染的黃曲霉菌一旦遇到適宜的環(huán)境，就會(huì)快速的生長繁殖，并產(chǎn)生毒素，造成黃曲霉毒素的污染和超標(biāo)。目前我國花生及其制品中黃曲霉污染嚴(yán)重，調(diào)查發(fā)現(xiàn)，江蘇、上海、廣東、廣西、福建、四川等肝癌高發(fā)病地區(qū)主要糧油產(chǎn)品中黃曲霉毒素B1 (AFB1)超標(biāo)現(xiàn)象比較常見。丁曉霞報(bào)道我國產(chǎn)后花生的黃曲霉總量檢出率高達(dá)29.6%。黃曲霉毒素污染嚴(yán)重影響著花生制品的食用安全性，已成為制約花生產(chǎn)業(yè)發(fā)展和食用安全的最大限制因子。
[0004]花生中黃曲霉毒素的污染雖在花生種植、收獲、加工、貯運(yùn)及銷售等環(huán)節(jié)均會(huì)發(fā)生，但研究表明受黃曲霉毒素污染的花生中的黃曲霉菌70%以上來自于花生土壤中的黃曲霉菌，花生在種植和收獲過程中被土壤中的黃曲霉菌侵染后，在各個(gè)環(huán)節(jié)遇適宜的環(huán)境則會(huì)快速繁殖并產(chǎn)生毒素，導(dǎo)致黃曲霉毒素的污染，即來自土壤中黃曲霉菌的浸染是導(dǎo)致花生及制品中黃曲霉毒素污染的主要因素。因此當(dāng)發(fā)生污染時(shí)，能夠借助一定的方法和技術(shù)來追溯黃曲霉菌污染發(fā)生的源頭，即追溯到污染花生的產(chǎn)地，再通過一定的技術(shù)方法(如改良種植方式、種植抗黃曲霉菌的花生品種、添加拮抗菌等)來減少土壤中黃曲霉菌，就可從根本上防控花生中黃曲霉毒素的污染；此外對(duì)于黃曲霉菌污染的花生產(chǎn)地溯源，還可為花生黃曲霉毒素的預(yù)警提供指導(dǎo)；因此對(duì)于花生中黃曲霉毒素污染防控，產(chǎn)地溯源至關(guān)重要，是解決黃曲霉毒素污染的根本所在。
[0005]目前，依靠傳統(tǒng)的表型溯源分析已不能滿足公共衛(wèi)生快速反應(yīng)體系的需要，因而開展相關(guān)微生物的分子特征研究，建立相應(yīng)的基因信息庫，并基于現(xiàn)代分子生物學(xué)理論的基因分型技術(shù)研究溯源已成為熱點(diǎn)。
[0006]眾所周知，微生物是地球上適應(yīng)性最強(qiáng)的生物，在地球的各類極端環(huán)境中都能發(fā)現(xiàn)它們的蹤影。微生物為適應(yīng)不同的生存環(huán)境，在漫長的進(jìn)化中產(chǎn)生了很多變異，造就了微生物豐富的遺傳多樣性。DNA溯源正是利用這種變異來判斷污染的來源，而建立能夠區(qū)別不同地區(qū)來源的黃曲霉菌DNA指紋圖譜方法是黃曲霉菌DNA產(chǎn)地溯源的關(guān)鍵所在。
[0007]DNA指紋圖譜源于個(gè)體基因組DNA序列的特異性，這種DNA序列的特異性通過分子標(biāo)記得以凸現(xiàn)。D N A指紋圖譜因?yàn)槠湟追中捅阌谝?guī)模化檢測，而且檢測手段簡單快捷、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)成為目前國際上公認(rèn)的最具發(fā)展?jié)摿Φ姆肿蛹夹g(shù)，應(yīng)用于眾多國家的食品追溯系統(tǒng)，如美國、法國、加拿大、比利時(shí)、意大利、日本、烏拉圭、澳大利亞和新西蘭等，而在我國則剛剛起步，且未見有關(guān)于食品中黃曲霉菌污染的DNA指紋圖譜建立的報(bào)道。DNA指紋圖譜使用的分子標(biāo)記有AFLP標(biāo)記(擴(kuò)增片段長度多態(tài)性)、SSR標(biāo)記(微衛(wèi)星標(biāo)記)、SNP標(biāo)記(單核苷酸多態(tài)性)和ISSR(簡單重復(fù)序列多態(tài)性)等。ISSR技術(shù)利用真核生物基因組內(nèi)廣泛存在的簡單重復(fù)序列設(shè)計(jì)單一通用引物，在此通用引物的3’或5’端加1-4個(gè)嘧啶堿基或錨定嘌呤，以此16-18bp的短重復(fù)序列作為引物，來擴(kuò)增兩個(gè)序列相同但方向相反的微衛(wèi)星重復(fù)序列之間的單拷貝序列，然后經(jīng)電泳分離獲得PCR擴(kuò)增圖譜，相比較其它的DNA分子標(biāo)記方法，ISSR引物設(shè)計(jì)簡單，具有普遍適用性、多態(tài)性高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，ISSR分子標(biāo)記已經(jīng)在遺傳多樣性、指紋圖譜的構(gòu)建、基因定位、品種鑒定、遺傳進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育等方面得到廣泛應(yīng)用。
[0008]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)建立不同產(chǎn)地花生黃曲霉菌DNA指紋圖譜的方法，其關(guān)鍵就是能夠找到能夠區(qū)別于不同地區(qū)來源的黃曲霉菌中的DNA位點(diǎn)，通過分子標(biāo)記技術(shù)尋找出具有產(chǎn)地屬性的黃曲霉菌DNA指紋圖譜，目前未見有利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)建立不同產(chǎn)地花生黃曲霉菌DNA指紋圖譜的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是在針對(duì)花生黃曲霉毒素污染產(chǎn)地溯源管理的需求，填補(bǔ)針對(duì)我國不同產(chǎn)地花生黃曲霉菌污染DNA溯源技術(shù)的缺口，提供一種針對(duì)我國花生不同產(chǎn)地屬性DNA指紋圖譜的構(gòu)建方法，以及由此方法得到的花生產(chǎn)地屬性的DNA指紋圖譜，從而能夠?yàn)榛ㄉS曲霉菌污染的產(chǎn)地溯源提供理論和參考依據(jù)和技術(shù)支持。
[0010]本發(fā)明的一種利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)建立不同產(chǎn)地花生黃曲霉菌DNA指紋圖譜的方法，
[0011]包括以下步驟:
[0012](I)黃曲霉菌的分離:對(duì)不同產(chǎn)地的花生進(jìn)行黃曲霉菌的分離、純化、鑒定。
[0013](2)樣品DNA提取:對(duì)來自不同產(chǎn)區(qū)的花生中分離的黃曲霉菌進(jìn)行DNA提取，通過純化試劑盒純化后-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0014](3)分別使用引物R1、R2、R3對(duì)提取的花生黃曲霉菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Rl引物為:AGA GAG AGA GAG AGA GG ;R2 引物為 CAC ACA CAC ACA CAC AA ;R3 引物為 AGA GTT GGTAGC TCT TGA TC0
[0015](4)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，記錄每條引物反應(yīng)的擴(kuò)增結(jié)果。電泳圖譜中每一條擴(kuò)增帶均代表引物與模板DNA互補(bǔ)的一對(duì)結(jié)合位點(diǎn)，可記為一個(gè)分子標(biāo)記，有帶的記為1，無帶的記為0，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
[0016](5)利用NTSYSpc (Vers1n 2.1Oe)軟件進(jìn)行聚類分析，獲得不同產(chǎn)地的花生黃曲霉菌DNA指紋圖譜。
[0017]優(yōu)選的，一種利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)建立不同產(chǎn)地花生黃曲霉菌DNA指紋圖譜的方法步驟(I)黃曲霉菌的分離方法為:取1g不同產(chǎn)地的花生，加入90mL 0.1%蛋白胨無菌水(w/v)，在室溫震蕩30min，制成10_1菌懸液；取0.1mL菌液，涂布在DG18培養(yǎng)基上，30°C黑暗培養(yǎng)5d。挑取長有黃色孢子的黃曲霉菌在DG18培養(yǎng)基上進(jìn)行二次劃線分離，直至得到單個(gè)菌落。挑取單個(gè)菌落的黃曲霉菌于MEA斜面試管培養(yǎng)基上，于30°C培養(yǎng)3d后保存于4°C中。黃曲霉菌的鑒定采用形態(tài)鑒定和分子鑒定，形態(tài)鑒定的方法是利用AFPA培養(yǎng)基進(jìn)行鑒定；黃曲霉和寄生曲霉在AFPA培養(yǎng)基上背面會(huì)產(chǎn)生亮橘色的顏色。具體操作為挑取保存于MEA培養(yǎng)基上的菌株于AFPA培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)3_5d，選擇AFPA培養(yǎng)基背面為亮橘色的菌株進(jìn)行分子鑒定。分子鑒定的方法為:通過真菌鈣調(diào)基因序列對(duì)菌株進(jìn)行分子鑒定(Rodrigues, et al.，2011)。黃曲霉基因組鈣調(diào)蛋白PCR擴(kuò)增所用的引物為CLl:GARTffCAAGGAGGCCTTCTC 和 CL2A:TTTTTGCATCATGAGTTGGAC0 PCR 擴(kuò)增條件為:PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min，I個(gè)循環(huán)；94°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸90s，共30個(gè)循環(huán)；72°C最后延伸7min。擴(kuò)增后，產(chǎn)物保存于4°C。產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果 BLAST researches 上比對(duì)(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/) ο
[0018]優(yōu)選的，一種利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)建立不同產(chǎn)地花生黃曲霉菌DNA指紋圖譜的方法步驟(2)黃曲霉菌DNA提取采用氯化芐法，DNA純化采用試劑盒柱層析法。
[0019]優(yōu)選的，一種利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)建立不同產(chǎn)地花生黃曲霉菌DNA指紋圖譜的方法步驟(3) PCR 反應(yīng)體系為(20 μ L) 10XPCR buffer 2.0 μ L，1.4U Taq DNA 聚合酶，0.35mmol/L dNTP，0.7 μ mol/L 引物，25ng 模板 DNA，1.75mmol/L MgCl20
[0020]反應(yīng)條件為:93°C預(yù)變性5min，l個(gè)循環(huán)；93°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸90s，共40個(gè)循環(huán)；72°C最后延伸6min。
[0021]優(yōu)選的，一種利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)建立不同產(chǎn)地花生黃曲霉菌DNA指紋圖譜的方法步驟(4)凝膠電泳條件為:1.4%瓊脂糖