[0133] 在每個(gè)Transwell小室上層加入無血清培養(yǎng)基和1XIO5個(gè)轉(zhuǎn)染了 EBV-miR-BARTlO或?qū)φ眨╯cramble)序列的鼻咽癌細(xì)胞，在Transwell小室下層加入含 20%胎牛血清的培養(yǎng)基。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)36小時(shí)后，用4%多聚甲醒固定液固定，結(jié)晶紫染 色，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，用PBS洗3遍。在顯微鏡下觀察穿過基質(zhì)膠膜的鼻咽 癌細(xì)胞。
[0134] 1.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)
[0135] 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是驗(yàn)證腫瘤細(xì)胞遷移能力的實(shí)驗(yàn)方法。轉(zhuǎn)染了邸V-miR-BARTlO或 對照（scramble)序列的鼻咽癌細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)，用200ulpipet 在每個(gè)6孔板中劃一條直線（劃痕），隨后在0、8、12、16、24、32、48小時(shí)等各個(gè)時(shí)間點(diǎn)（視 不同細(xì)胞遷移能力而定）在顯微鏡下觀察劃痕愈合情況，拍照，并計(jì)算各組細(xì)胞遷移速度。
[0136] 2.結(jié)果
[0137] 2. 1轉(zhuǎn)染邸V-miR-BARTlO后，鼻咽癌細(xì)胞中邸V-miR-BARTlO的表達(dá)水平顯著升高
[0138] 在邸V陰性的鼻咽癌細(xì)胞H肥2中轉(zhuǎn)染邸V-miR-BARTlO后，EBV-miR-BARTlO在鼻 咽癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高（圖5)，表明EBV-miR-BARTlO轉(zhuǎn)染成功。
[0139] 2. 2在鼻咽癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染邸V-miR-BARTlO后細(xì)胞侵襲能力升高
[0140] 細(xì)胞穿膜（transwell)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在鼻咽癌細(xì)胞系H肥2中轉(zhuǎn)入邸V-miR-BARTlO 后，能穿過基質(zhì)膠膜的鼻咽癌細(xì)胞數(shù)目顯著增加，表明細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)（圖6)。
[014。 2. 3在鼻咽癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染EBV-miR-BARTlO后細(xì)胞遷移能力增加
[0142] 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在鼻咽癌細(xì)胞系H肥2中轉(zhuǎn)入邸V-miR-BARTlO后鼻咽癌細(xì)胞 從劃痕兩邊往劃痕中央遷移的速度加快，劃痕愈合的時(shí)間縮短，表明細(xì)胞運(yùn)動遷移能力增 強(qiáng)（圖7)。
[0143] 實(shí)施例4,荷載反義寡核巧酸的納米顆粒抑制鼻咽癌細(xì)胞中EBV-miR-BARTlO的表 達(dá)
[0144] 1.材料方法
[014引 1. 1EBV-miR-BARTlO的反義寡核巧酸
[0146]EBV-miR-BARTlO的反義寡核巧酸通過化學(xué)合成法合成，序列如下： 陽 147]ACAGCCAACUCCAUGGUUAUGUA
[014引1. 2制備多聚賴氨酸包被的娃納米顆粒
[0149] 多聚賴氨酸包被的娃納米顆粒是運(yùn)用OPlO/環(huán)己燒/氨水微乳液自組裝技術(shù)進(jìn)行 娃納米顆粒（silicananoparticle,SiNP)的合成，并利用娃納米顆粒的表面能和通過離 子靜電作用，制備多聚賴氨酸修飾的娃納米顆粒；所述的納米顆?？蒞由W下方法制備得 到：
[0150] 1)將0P-10、環(huán)己燒和氨水混合，室溫?cái)埌杈鶆蚝蠹尤胝匏岙惔祝═E0巧，繼續(xù)攬 拌至聚合完成，加入等體積丙酬，超聲分散，離屯、，雙蒸水洗涂=次，離屯、收集沉淀于80°C干 燥，研細(xì)得娃納米顆粒（SiN巧。其中&0與OP-IO及&0與TEOS的摩爾比為2~10、氨水 濃度為1. 6~28%、TEOS在環(huán)己燒中的摩爾濃度為0. 1~3mol/L。
[0151] 2)將SiNP按0. 1~lOmg/ml重懸于0. 6M化C〇3溶液中，超聲分散，離屯、，棄上清， 再將沉淀物按0. 1~lOmg/ml重懸于PBS(抑7. 4)中，超聲分散，加多聚賴氨酸（終濃度為 4~15nmol/mL)，充分混勻，室溫混搖；離屯、，棄上清，沉淀重懸于雙蒸水中，得到多聚賴氨 酸修飾的娃納米顆粒。多聚賴氨酸的終濃度為4~15nmol/mL。
[0152] 3)將改性娃納米顆粒超聲分散，按質(zhì)量比5~30:1與邸V-miR-BARTlO的反義寡 核巧酸混合，室溫靜置使其結(jié)合。
[0153] 1.3細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
[0154] 將生長狀態(tài)良好的邸V陽性鼻咽癌細(xì)胞C666-1按2XIO5個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔 板中，將6孔板置于37°C，5%C〇2培養(yǎng)箱中，待培養(yǎng)細(xì)胞生長至50-70%密度即可開始轉(zhuǎn)染 EBV-miR-BARTlO反義寡核巧酸；轉(zhuǎn)染過程如下：
[015引在無菌EP管中加入100y1制備好的攜帶邸V-miR-BARTlO反義寡核巧酸的多聚 賴氨酸修飾的娃納米顆粒懸液，與100y1無血清培養(yǎng)基溫和混勻；用D-Hank'S液洗涂細(xì)胞 3次；將上述混合物中加入800y1無血清培養(yǎng)基（無抗生素），混和混勻后加入6孔板中的 1個(gè)孔；將6孔板置于C02培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)6小時(shí)，然后棄上清，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培 養(yǎng)過夜。用攜帶Scramble序列反義寡核巧酸的多聚賴氨酸修飾娃納米顆粒作為實(shí)驗(yàn)對照。
[0156] 1. 4實(shí)時(shí)定量PCR檢測反義寡核巧酸抑制邸V-miR-BARTlO表達(dá)的效果：
[0157] 細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功后，抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)巧光定量PCR法檢測邸V-miR-BARTlO 的表達(dá)，方法和步驟同實(shí)施例1。
[015引1. 5細(xì)胞穿膜實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)同實(shí)施例3。
[0159] 2.結(jié)果
[0160] 2. 1反義寡核巧酸可顯著抑制邸V-miR-BARTlO的表達(dá)
[0161] 在邸V陽性的鼻咽癌細(xì)胞系C666-1中導(dǎo)入邸V-miR-BARTlO的反義寡核巧酸 度ARTlOIn)后，實(shí)時(shí)巧光定量PCR方法檢測了C666-1細(xì)胞中邸V-miR-BARTlO的表達(dá)情況， EBV-miR-BARTlO的表達(dá)均受到明顯的抑制。陰性對照（NC)為scramble的反義寡核巧酸 (圖 8)。
[0162] 2. 2反義寡核巧酸抑制邸V-miR-BARTlO的表達(dá)后，細(xì)胞侵襲能力降低
[0163] 細(xì)胞穿膜（transwell)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在鼻咽癌細(xì)胞系C666-1中導(dǎo)入邸V-miR-BARTlO 的反義寡核巧酸度ARTlOIn)后，能穿過基質(zhì)膠膜的鼻咽癌細(xì)胞數(shù)目顯著減少，表明細(xì)胞侵 襲能力降低（圖9)。
[0164] 2. 3反義寡核巧酸抑制邸V-miR-BARTlO的表達(dá)后，細(xì)胞遷移能力降低
[0165] 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在鼻咽癌細(xì)胞系C666-1中導(dǎo)入邸V-miR-BARTlO的反義寡核 巧酸度ARTlOIn)后，鼻咽癌細(xì)胞從劃痕兩邊往劃痕中央遷移的速度減慢，劃痕愈合的時(shí)間 延長，表明細(xì)胞運(yùn)動遷移能力降低（圖10)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. EB病毒編碼的microRNA BARTlO反義寡核苷酸的應(yīng)用方法，其特征在 于，用于制備防治鼻咽癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的制劑；所述的反義寡核苷酸的序列是 ACAGCCAACUCCAUG⑶UA腳A〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的制劑是將EBV-miR-BARTIO的 反義寡核苷酸負(fù)載到多聚賴氨酸修飾的娃納米顆粒上制成納米球。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用方法，其特征在于， 多聚賴氨酸修飾的硅納米顆粒是運(yùn)用0P-10、環(huán)己烷、氨水的微乳液自組裝技術(shù)進(jìn)行硅 納米顆粒的合成，并利用硅納米顆粒的表面能和離子靜電作用進(jìn)行多聚賴氨酸表面修飾， 制備得到。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用方法，其特征在于，制備多聚賴氨酸修飾的硅納米顆粒： 1) 將0P-10、環(huán)己烷和氨水混合，室溫?cái)嚢杈鶆蚝蠹尤胝杷岙愼?，繼續(xù)攪拌至聚合完 成，加入等體積丙酮，超聲分散，離心，雙蒸水洗滌三次，離心收集沉淀于80°C干燥，研細(xì)得 粒徑范圍10-50nm的硅納米顆粒；其中H 2O與0P-10及H2O與正硅酸異酯的摩爾比為2~ 10、氨水濃度為1. 6~28%、正娃酸異酯在環(huán)己燒中的摩爾濃度為0. 1~3mol/L ; 2) 將娃納米顆粒按0. 1~10mg/ml重懸于0. 6M NaCOl^液中，超聲分散;，離心，棄上 清，再將沉淀物按0. 1~lOmg/ml重懸于pH 7. 4的PBS中，超聲分散，加多聚賴氨酸，終濃 度為4~15nmol/mL，充分混勾，室溫混搖；離心，棄上清，沉淀按0. 1~lOmg/ml重懸于雙 蒸水中，得到多聚賴氨酸修飾的硅納米顆粒。5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用方法，其特征在于，將多聚賴氨酸修飾的硅納米顆粒 超聲分散，每毫升納米顆粒懸液加入10~50ug EBV-miR-BART10反義寡核苷酸，混合，室溫 靜置使其結(jié)合。 6. EB病毒編碼的microRNA BART10反義寡核苷酸，序列是ACAGCCAACUCCAUGGUUAUGUA。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種EB病毒編碼的microRNA？BART10(EBV-miR-BART10)反義寡核苷酸的應(yīng)用方法，具體涉及EBV-miR-BART10反義寡核苷酸在制備防治鼻咽癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的制劑中的應(yīng)用。通過研究證實(shí)EBV-miR-BART10在鼻咽癌組織中表達(dá)上調(diào)，高表達(dá)EBV-miR-BART10的鼻咽癌患者比低表達(dá)EBV-miR-BART10的鼻咽癌患者更容易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后更差，因此EBV-miR-BART10的反義寡核苷酸有望進(jìn)一步應(yīng)用于防治鼻咽癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。體現(xiàn)本發(fā)明所述用途的藥物，可以保護(hù)反義寡核苷酸免受核酸酶降解，延長作用時(shí)間，有更高的轉(zhuǎn)染效率，有利于進(jìn)一步的開發(fā)和應(yīng)用。
【IPC分類】A61K48/00, A61K9/14, A61K47/02, A61P35/00, C12N15/113, A61K47/34
【公開號】CN105154446
【申請?zhí)枴緾N201510422934
【發(fā)明人】李桂源, 曾朝陽, 熊煒, 李小玲, 晏其佳, 何寶玉, 李夏雨, 鄧昊, 龔朝建, 陳攀, 石磊, 熊芳
【申請人】中南大學(xué)
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2015年7月17日