一種綠盲蝽絲氨酸蛋白酶AlSP4、其多克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種綠盲睹絲氨酸蛋白酶A1SP4、其多克 隆抗體及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 綠盲睹ApolygusIucorum化emiptera:Mi;ridae)屬半翅目盲睹科，是棉花、果樹(shù)、 蔬菜、首猜等多種農(nóng)作物上的重要害蟲(chóng)。近年來(lái)，由于化棉的大面積推廣和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu) 調(diào)整等原因，綠盲睹種群數(shù)量急劇上升，加之長(zhǎng)期主要依賴化學(xué)農(nóng)藥防治，勢(shì)必會(huì)加速綠盲 睹抗藥性的上升，導(dǎo)致目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的綠盲睹防控面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，急待開(kāi)拓減少化學(xué)農(nóng) 藥使用的新型無(wú)公害防控手段。
[0003] 綠盲睹寄主眾多、食性雜，而不同寄主植物包含的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)具有很大差別，害蟲(chóng)體 內(nèi)消化酶活性強(qiáng)弱與攝入營(yíng)養(yǎng)的類型和含量有關(guān)，可W反映害蟲(chóng)對(duì)寄主植物營(yíng)養(yǎng)消化的能 力，進(jìn)而影響害蟲(chóng)本身的生長(zhǎng)速度。因此，明確并抑制綠盲睹取食特定寄主后特異性消化酶 的種類及活性對(duì)于發(fā)掘綠盲睹新型防控措施具有重要意義。在昆蟲(chóng)眾多消化酶中，絲氨酸 蛋白酶是其消化系統(tǒng)內(nèi)重要的消化酶，包括彈性蛋白酶、類膜蛋白酶及類膜凝乳蛋白酶等。 綠盲睹A1SP4基因在其取食不同寄主后，基因表達(dá)量呈現(xiàn)顯著差異，尤其針對(duì)化棉。而在昆 蟲(chóng)體內(nèi)實(shí)際行使功能的不是酶基因而是酶蛋白。因此，急需靈敏度高，特異性好的蛋白檢測(cè) 技術(shù)來(lái)分析綠盲睹寄主轉(zhuǎn)換過(guò)程中A1SP4酶蛋白的表達(dá)量，從而探尋天然植物源的A1SP4 酶蛋白抑制，進(jìn)而探索綠盲睹的新型防控技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明目的：本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種重組表達(dá)載體。 陽(yáng)〇化]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種轉(zhuǎn)基因重組菌。
[0006] 本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供一種綠盲睹A1SP4蛋白的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種綠盲睹A1SP4蛋白多克隆抗體。
[0008] 本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供一種綠盲睹A1SP4蛋白多克隆抗體的制備方法。
[0009] 本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種綠盲睹A1SP4蛋白多克隆抗體的表達(dá)量特異性 Westernblot檢測(cè)方法。 陽(yáng)010] 技術(shù)方案：本發(fā)明中采用的A1SP4基因全長(zhǎng)、預(yù)測(cè)蛋白的序列號(hào)在NCBIOfetional CenterofBiotechnologyInformation)上的登錄號(hào)為JQ609682。
[0011] 為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種重組表達(dá)載體，含有用于編碼 綠盲睹AlSP4蛋白的DNA序列。
[0012] 進(jìn)一步地，將所述的DNA序列插入到大腸桿菌表達(dá)載體中得到的表達(dá)綠盲睹 A1SP4蛋白的重組表達(dá)載體。
[0013] 進(jìn)一步地，所述大腸桿菌表達(dá)載體為pSUMO-Mut。
[0014] 一種轉(zhuǎn)基因重組菌，所述重組菌是將所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中，篩選 得到轉(zhuǎn)基因重組菌。
[0015] 進(jìn)一步地，所述的大腸桿菌為ArcticExpress。
[0016] 一種綠盲睹A1SP4蛋白的制備方法，包括W下步驟：
[0017] 1)、編碼綠盲睹A1SP4開(kāi)放閱讀框CDNA雙鏈的PCR擴(kuò)增；
[0018] 2)、綠盲睹A1SP4蛋白的原核表達(dá)載體構(gòu)建；
[0019] 3)、HIS-Tag標(biāo)簽抗體的Western-blot驗(yàn)證；
[0020] 4)、綠盲睹AlSP4蛋白的變性與復(fù)性；
[0021] 5)、綠盲睹A1SP4蛋白的分離、純化即得到重組的綠盲睹A1SP4蛋白。
[0022] 一種綠盲睹A1SP4蛋白多克隆抗體，將得到的重組的綠盲睹A1SP4蛋白免疫新西 蘭大白兔后制得。
[0023] 一種綠盲睹A1SP4蛋白多克隆抗體制備方法，包括W下步驟：
[0024]1)、將重組的綠盲睹A1SP4蛋白免疫新西蘭大白兔； 陽(yáng)0巧]2)、抗原親和純化法獲得針對(duì)A1SP4蛋白的多克隆抗體；
[0026] 3)、A1SP4蛋白的多克隆抗體效價(jià)的化LSA檢測(cè)。
[0027] 一種綠盲睹A1SP4蛋白多克隆抗體的表達(dá)量特異性Westernblot檢測(cè)方法，包括 W下步驟：
[0028] 1)、取2日齡綠盲睹成蟲(chóng)提取的總蛋白及體外重組表達(dá)純化的A1SP4蛋白，采用聚 丙締酷胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、洗膜、封閉。
[0029] 2)、用封閉液稀釋一抗（本發(fā)明制作的A1SP4蛋白多克隆抗體），膜在一抗稀釋液 中反應(yīng)，洗膜，封閉液稀釋羊抗兔的酶標(biāo)二抗，膜在二抗中反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光顯影。
[0030] 有益效果：本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有W下優(yōu)點(diǎn)：將原核表達(dá)純化的A1SP4重組 蛋白應(yīng)用于免疫新西蘭大白兔后制備了多克隆抗體，在通過(guò)利用ELISA法確定了該多克隆 抗體的效價(jià)后，發(fā)明人采用Westernblot法發(fā)現(xiàn)該多克隆抗體能特異性識(shí)別原核表達(dá)純化 的A1SP4重組蛋白，可產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)?；诖?，發(fā)明人還建立了一套高效、高靈敏度 和準(zhǔn)確的Westernblot方法，可特異性地從綠盲睹蟲(chóng)體內(nèi)檢測(cè)出A1SP4蛋白。應(yīng)用本發(fā) 明，可為絲氨酸蛋白酶類酶蛋白在綠盲睹體內(nèi)的組織分布W及該蛋白的快速檢測(cè)和分子生 物學(xué)研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。此外，與常規(guī)表達(dá)載體（如PET28a)及大腸桿菌（如 BL21)搭配組合表達(dá)A1SP4蛋白較少，蛋白電泳幾乎沒(méi)有條帶相比，本發(fā)明利用pSUMO-Mut 表達(dá)載體合理搭配ArcticExpress菌的方法卻可W大量體外重組表達(dá)綠盲睹消化酶 A1SP4蛋白，并為進(jìn)一步系統(tǒng)研究綠盲睹分子消化機(jī)制提供了堅(jiān)實(shí)的研究基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0031] 圖1 :A1SP4基因開(kāi)放閱讀框及構(gòu)建雙酶切位點(diǎn)PCR擴(kuò)增電泳圖；泳道1 :為2000bp 的DNAmaker;泳道2 :A1SP4基因開(kāi)放閱讀框；泳道2 :A1SP4基因開(kāi)放閱讀框兩端分別加上 StuI及化ndllI酶切位點(diǎn)后的PCR圖譜；
[0032] 圖2pSUM0-Mut-AlSP4利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)經(jīng)10%SDS-PAGE分析電泳圖；泳道M: 為蛋白maker;泳道1 :未經(jīng)誘導(dǎo)菌株的總蛋白；泳道2 :空載體誘導(dǎo)菌株的總蛋白；泳道3 : 經(jīng)0.SmMIPTG在37°C誘導(dǎo)祀標(biāo)載體表達(dá)的總蛋白上清液；泳道4 :經(jīng)0.SmMIPTG在37°C 誘導(dǎo)祀標(biāo)載體表達(dá)的總蛋白包涵體；
[0033] 圖3 :A1SP4蛋白重組表達(dá)后的HIS-Tag標(biāo)簽抗體Western雜交驗(yàn)證圖；M:為 IOOkd蛋白maker;泳道1 :為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌株樣品；泳道2 :空載體對(duì)照（pSUMO-Mut); 泳道3 :為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌株樣品上清；泳道4 :為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌株樣品包涵體；
[0034] 圖4 :A1SP4蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，純化后經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分析圖譜；泳道M:為蛋 白maker;泳道1 :經(jīng)0. 5mMIPTG在不同溫度條件下誘導(dǎo)祀標(biāo)載體表達(dá)的總蛋白包涵體；泳 道2:純化后的A1SP4祀標(biāo)蛋白；
[0035] 圖5 :A1SP4蛋白特異性抗體純化、電泳分離后，考馬斯亮藍(lán)染色圖譜；
[0036] 圖6 :矛Ll用A1SP4蛋白特異性膚鏈抗體Western雜交圖譜；M:為200kd蛋白maker; 內(nèi)參：為同一張膜P-actin蛋白Western雜交圖譜；泳道1 :2日齡綠盲睹成蟲(chóng)組織內(nèi) A1SP4蛋白Western雜交圖譜；泳道2 :含有SUMO-Tag標(biāo)簽的A1SP4重組蛋白Western雜交 圖譜（陽(yáng)性對(duì)照），泳道3 :空白陰性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作更進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0038] 實(shí)施例1 :A1SP4全長(zhǎng)基因開(kāi)放閱讀框CDNA的獲得
[0039] 采用TRIzol法提取2日齡綠盲睹成蟲(chóng)總RNA，選擇電泳圖譜良好并且0D260/ 0D280值在1. 8~2. 0之間的總RNA樣品合并進(jìn)行mRNA的純化，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA， PCR反應(yīng)體系為：0.5yg總RNA，0.5yl01ig〇-dT18,2yl5X反應(yīng)緩沖液，IOmM dNTP，40URNasin，200USuperscriptII，加d地2〇 至 10y1;PCR反應(yīng)參數(shù)為：42°C30min， 75°C30min，4°C5min。根據(jù)NCBI綠盲睹A1SP4基因開(kāi)放閱讀框已知序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引 物A1SP4-1F巧'-ATGATGAAGTGTTTGTTACTAGTAGCT-3')及A1SP4-1R巧'-TTATTCCGACATT TTGAAAGG-3')，獲得A1SP4基因開(kāi)放閱讀框cDNA序列，PCR反應(yīng)體系為：2. 5y1IOX反 應(yīng)緩沖液，2y1 25mMMg2+，2y1IOmMdNTP，0. 5y1TaqplusDNA聚合酶，1y1 10yM上 游引物A1SP4-1F，1y1 10yM下游引物A1SP4-1R，cDNA模板 1y1，加d地20 至 25y1;PCR 反應(yīng)參數(shù)為：95°CSmin;95°C30s，55. 6°C30s，72°C90s，40 個(gè)循環(huán)；72°C繼續(xù)延伸lOmin， 得到與預(yù)期大小999bp相符的條帶，并將PCR產(chǎn)物經(jīng)I. 2%瓊脂糖凝膠電泳分離和膠回收純 化目的DNA(圖1)。W純化A1SP4基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物A1SP4-2F巧'-AGGCCTATG ATG