為25 mmol/L的HEPES (pH=7.6)加入到混合體系C中，得到混合體系D ;取I份濃度為2 mmol/L ATP加入到混合體系D中，得到混合體系E ;取I份濃度為5mmol/L谷胱苷肽加入到混合體系E中，混合均勻，用0.2 μπι針頭過濾器過濾除菌，得到哺乳動物細(xì)胞電轉(zhuǎn)染緩沖液。
[0020]電轉(zhuǎn)染:轉(zhuǎn)染前3天，復(fù)蘇中國倉鼠卵巢CHO細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫)，將細(xì)胞放入培養(yǎng)瓶中加10%的FBS+ RPM1-1640于37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前一天，傳代培養(yǎng)復(fù)蘇成纖維細(xì)胞。吸出培養(yǎng)液，用PBS沖洗3遍，向瓶內(nèi)加入適量的0.25%胰蛋白酶，5min后加入RPMI 1640培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打使細(xì)胞脫落，離心(1000 rpm, 5 min)后去上清液，用RPMI 1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，按5 X 14個/ml的密度傳代培養(yǎng)。利用胰酶消化貼壁細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，用PBS清洗兩遍，小心懸浮、計數(shù)，細(xì)胞數(shù)為7 X 15個/ml ;去除PBS，利用本發(fā)明公開的電轉(zhuǎn)染緩沖液進(jìn)行懸浮，加入已去內(nèi)毒素大提質(zhì)粒pDsRed2-Nl(購自Clontech，操作方法參見QIAGEN 12163質(zhì)粒大提試劑盒)1ug至體積為10ul的細(xì)胞懸液中，再將混合液放入到0.2cm的電擊杯中，選擇方波條件下，設(shè)置電壓160V，15ms，I次脈沖參數(shù)進(jìn)行電擊(設(shè)置參數(shù)參照B1-Rad電轉(zhuǎn)染儀說明書)。將電擊后的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入5ml RPMI 1640 (含10%FBS)繼續(xù)培養(yǎng)。在相同條件下，利用PBS緩沖液和Cytomix緩沖液將pDsRed2-Nl質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞中。
[0021]轉(zhuǎn)染24小時后，收集懸浮細(xì)胞，然后利用胰酶消化貼壁細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，用PBS清洗兩遍。取一半細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀分選瞬時轉(zhuǎn)染RFP陽性標(biāo)記細(xì)胞(結(jié)果見圖1);用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞存活率(結(jié)果見圖2)。
[0022]實施例3 HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒
配制電轉(zhuǎn)染緩沖液:稱取 8.94g KCl、0.01665g CaCl2U.74 g K2HPO4、0.475g MgCl2,加入無菌水定容至I升，混合得到Cytosalts溶液；取75份Cytosalts溶液，加入25份Opt1-MEM培養(yǎng)基，得到混合體系A(chǔ) ;取5份RPM1-1640培養(yǎng)基加入到混合體系A(chǔ)中，得到混合體系B ;取I份PBS緩沖液加入到混合體系B中，得到混合體系C ;取I份濃度為25 mmol/L的HEPES (pH=7.6)加入到混合體系C中，得到混合體系D ;取10份濃度為2 mmol/L ATP加入到混合體系D中，得到混合體系E ;取5份濃度為5mmol/L谷胱苷肽加入到混合體系E中，混合均勻，用0.2 μπι針頭過濾器過濾除菌，得到哺乳動物細(xì)胞電轉(zhuǎn)染緩沖液。
[0023]電轉(zhuǎn)染:轉(zhuǎn)染前3天，復(fù)蘇ΗΕΚ293細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫)，將細(xì)胞放入培養(yǎng)瓶中加10%的FBS+DMEM于37°C、5% 0)2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前一天，傳代培養(yǎng)復(fù)蘇成纖維細(xì)胞。吸出培養(yǎng)液，用PBS沖洗3遍，向瓶內(nèi)加入適量的0.25%胰蛋白酶，5min后加入DMEM培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打使細(xì)胞脫落，離心(1000 rpm, 5 min)后去上清液，用DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，按5 X 14個/ml的密度傳代培養(yǎng)。利用胰酶消化貼壁細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，用PBS清洗兩遍，小心懸浮、計數(shù)，細(xì)胞數(shù)為7 X 15個/ml ;去除PBS，利用本發(fā)明公開的電轉(zhuǎn)染緩沖液進(jìn)行懸浮，加入已去內(nèi)毒素大提質(zhì)粒pEGFP-ΝΙ (購自Clontech，操作方法參見QIAGEN 12163質(zhì)粒大提試劑盒)1ug至體積為10ul的細(xì)胞懸液中，再將混合液放入到0.2cm的電擊杯中，選擇方波條件下，電壓110V，25ms，I次脈沖參數(shù)進(jìn)行電擊(設(shè)置參數(shù)參照B1-Rad電轉(zhuǎn)染儀說明書)。將電擊后的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入5mlDMEM(含10%FBS)繼續(xù)培養(yǎng)。在相同條件下，利用PBS緩沖液和Cytomix緩沖液將pEGFP-Nl質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞中。
[0024]轉(zhuǎn)染24小時后，收集懸浮細(xì)胞，然后利用胰酶消化貼壁細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，用PBS清洗兩遍，然后，采用流式細(xì)胞儀分選瞬時轉(zhuǎn)染GFP陽性標(biāo)記細(xì)胞(結(jié)果見圖1);用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞存活率(結(jié)果見圖2)。
[0025]實施例4人肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒
配制電轉(zhuǎn)染緩沖液:稱取 8.94g KCl、0.01665g CaCl2U.74 g K2HPO4、0.475g MgCl2,加入無菌水定容至I升，混合得到Cytosalts溶液；取50份Cytosalts溶液，加入10份Opt1-MEM培養(yǎng)基，得到混合體系A(chǔ) ;取I份RPM1-1640培養(yǎng)基加入到混合體系A(chǔ)中，得到混合體系B ;取3份PBS緩沖液加入到混合體系B中，得到混合體系C ;取10份濃度為25 mmol/L的HEPES (pH=7.6)加入到混合體系C中，得到混合體系D ;取10份濃度為2 mmol/L ATP加入到混合體系D中，得到混合體系E ;取10份濃度為5mmol/ L谷胱苷肽加入到混合體系E中，混合均勻，用0.2 μπι針頭過濾器過濾除菌，得到哺乳動物細(xì)胞電轉(zhuǎn)染緩沖液。
[0026]電轉(zhuǎn)染:轉(zhuǎn)染前3天，復(fù)蘇Α549細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫)，將細(xì)胞放入培養(yǎng)瓶中加10%的FBS+ RPM1-1640于37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前一天，傳代培養(yǎng)復(fù)蘇成纖維細(xì)胞。吸出培養(yǎng)液，用PBS沖洗3遍，向瓶內(nèi)加入適量的0.25%胰蛋白酶，5min后加入RPMI 1640培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打使細(xì)胞脫落，離心(1000 rpm, 5 min)后去上清液，用RPMI 1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，按5 X 14個/ml的密度傳代培養(yǎng)。利用胰酶消化貼壁細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，用PBS清洗兩遍，小心懸浮、計數(shù)，細(xì)胞數(shù)為7X 15個/ml ;去除PBS，利用本發(fā)明公開的電轉(zhuǎn)染緩沖液進(jìn)行懸浮，加入已去內(nèi)毒素大提質(zhì)粒pEGFP-Nl (購自Clontech，操作方法參見QIAGEN 12163質(zhì)粒大提試劑盒)IlOug至體積為10ul的細(xì)胞懸液中，再將混合液放入到0.2cm的電擊杯中，選擇方波條件下，電壓150V，10ms，I次脈沖參數(shù)進(jìn)行電擊(設(shè)置參數(shù)參照B1-Rad電轉(zhuǎn)染儀說明書)。將電擊后的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入5ml RPMI 1640 (含10%FBS)繼續(xù)培養(yǎng)。在相同條件下，利用PBS緩沖液和Cytomix緩沖液將pEGFP-Nl質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中。
[0027]轉(zhuǎn)染24小時后，收集懸浮細(xì)胞，然后利用胰酶消化貼壁細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，用PBS清洗兩遍，然后，采用流式細(xì)胞儀分選瞬時轉(zhuǎn)染GFP陽性標(biāo)記細(xì)胞(結(jié)果見圖1);用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞存活率(結(jié)果見圖2)。
【主權(quán)項】
1.哺乳動物細(xì)胞高效電轉(zhuǎn)染緩沖液及其制備方法，其特征在于該方法的工藝步驟如下: (1)稱取8.94g KC1、0.01665g CaCl2U.74 g K2HPO4'0.475g MgCl2，加入無菌水定容至I升，混合得到Cytosalts溶液； (2)取50-100份步驟(I)得到的Cytosalts溶液，加入10-25份Opt1-MEM培養(yǎng)基，得到混合體系A(chǔ) ； (3)取1-5份RPM1-1640培養(yǎng)基加入到步驟(2)得到的混合體系A(chǔ)中，得到混合體系B ；(4)取1-5份PBS緩沖液加入到步驟(3)得到的混合體系B中，得到混合體系C; (5)取1-10份濃度為25mmol/ L、pH值為7.6的HEPES加入到步驟(4)得到的混合體系C中，得到混合體系D ； (6)取1-10份濃度為2mmol/ L ATP加入到步驟(5)得到的混合體系D中，得到混合體系E ； (7)取1-10份濃度為5mmol/ L谷胱苷肽加入到步驟(6)得到的混合體系E中，混合均勻，過濾除菌，得到電轉(zhuǎn)染緩沖液； 以上所加物料的份數(shù)均為體積份。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的哺乳動物細(xì)胞高效電轉(zhuǎn)染緩沖液及其制備方法，其特征在于所述的哺乳動物細(xì)胞是體外培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的哺乳動物細(xì)胞高效電轉(zhuǎn)染緩沖液及其制備方法，其特征在于所述的哺乳動物細(xì)胞是體外培養(yǎng)的3T3-L1細(xì)胞、CHO細(xì)胞、HEK293細(xì)胞和A549細(xì)胞中的任意一種。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的哺乳動物細(xì)胞高效電轉(zhuǎn)染緩沖液及其制備方法，其特征在于所述的電轉(zhuǎn)染的基因物質(zhì)為DNA片段。
【專利摘要】本發(fā)明公開了哺乳動物細(xì)胞高效電轉(zhuǎn)染緩沖液，該緩沖液是對Cytomix緩沖液的進(jìn)一步改良。該緩沖液中加入的無血清Opti-MEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基及PBS緩沖液能對細(xì)胞起營養(yǎng)保護作用，能增加細(xì)胞存活率，同時加入的ATP和谷氨酰胺可阻止細(xì)胞質(zhì)成分滲漏，加強細(xì)胞膜抗氧化作用，有利于電穿孔的重新閉合。本發(fā)明公開的電轉(zhuǎn)染緩沖液，能夠明顯提高外源基因在目標(biāo)細(xì)胞的電轉(zhuǎn)染效率（高達(dá)64.82%），并能提高細(xì)胞存活率（高達(dá)62.33%）。本發(fā)明還提供了該電轉(zhuǎn)染緩沖液的制備方法，該方法操作簡單，可操作性強。
【IPC分類】C12N15/85
【公開號】CN105154472
【申請?zhí)枴緾N201510638518
【發(fā)明人】周勇, 申友鋒
【申請人】重慶高圣生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2015年9月28日