一種高效安全的轉(zhuǎn)座子整合系統(tǒng)及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，設(shè)及一種高效安全的轉(zhuǎn)座子整合系統(tǒng)及其用途。本 發(fā)明還設(shè)及一種核酸構(gòu)建體及其用途。所述核酸構(gòu)建體能夠用于介導(dǎo)外源基因在宿主細胞 內(nèi)高效整合，并高效穩(wěn)定表達，且整合位點主要集中在宿主細胞基因組內(nèi)的3個基因間區(qū) 段，能較大程度上避免隨機插入引發(fā)的風(fēng)險。本發(fā)明還設(shè)及含有該核酸構(gòu)建體的重組載體 和重組宿主細胞。
【背景技術(shù)】
[0002] 外源基因在宿主細胞內(nèi)的表達形式可分為瞬時表達與穩(wěn)定表達，其中穩(wěn)定表達是 指：（1)外源基因轉(zhuǎn)染真核細胞并整合入基因組后的表達。重組基因的穩(wěn)定表達水平一般 要比短暫表達低1~2個數(shù)量級。（2)宿主細胞雖經(jīng)過多次傳代或條件變化，但表達水平仍 然保持穩(wěn)定。
[0003] 鑒于穩(wěn)定表達能隨著細胞分裂維持外源基因長時間持續(xù)表達，在離體細胞修 飾（exvivo),如轉(zhuǎn)基因嵌合抗原受體T細胞（QiimericAntigenReceptorT-Cell Immunotherapy，CAR-T)治療研究中具有重要意義。CAR-T細胞能特異識別并高效殺傷表 達特定細胞表面抗原的腫瘤細胞，已取得顯著的臨床療效。如針對CD19的CAR-T能高效 殺傷表達CD19表面抗原的B細胞淋己瘤，對晚期難治性B細胞淋己瘤患者，有效緩解率達 到 90 %(MaudeSl^,Rr巧N,化awPA,AplencR,BarrettDM,BuninNJ,QiewA,Gonzalez VE,ZhengZ,LaceySF,MahnkeYD,MelenhorstJJ,RheingoldSR,ShenA,Teachey DT,LevineBL,JuneCH,PorterDL,GruppSA.ChimericantigenreceptorTcellsfor sustainedremissionsinleukemia.NEnglJMed. 2014 ;371 (16):1507-17)。
[0004] 為實現(xiàn)外源基因在宿主細胞內(nèi)的穩(wěn)定表達，常用的載體系統(tǒng)包括：1.逆轉(zhuǎn)錄病毒 系統(tǒng)：能有效感染宿主細胞，并介導(dǎo)外源基因表達框的基因組高效整合，但其裝載容量有 限，且重組病毒顆粒制備工藝復(fù)雜。2.真核表達質(zhì)粒系統(tǒng)：制備工藝相對簡單，但其通過隨 機DNA重組的方式插入宿主基因組，整合效率極低。3.轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)：采用質(zhì)粒系統(tǒng)，制備工 藝相對簡單，通過轉(zhuǎn)座酶將外源基因整合入基因組，整合效率相對較低。
[0005] 最早應(yīng)用的哺乳動物轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)是源于魚類的"睡美人"轉(zhuǎn)座子（Slewing Beauty),但是"睡美人"轉(zhuǎn)座子存在過量抑制效應(yīng)和攜帶片段偏小巧化左右）等缺陷，使 其在轉(zhuǎn)基因應(yīng)用上受到限制。來源于鱗翅目昆蟲的PiggyBac(PB)轉(zhuǎn)座子是目前哺乳動物 中活性最高的轉(zhuǎn)座子。其宿主范圍極其廣泛，從單細胞生物到哺乳動物都能夠發(fā)揮作用； 能夠攜帶較大的外源DNA片段，當(dāng)轉(zhuǎn)座片段在1地bW內(nèi)時，轉(zhuǎn)座效率不會顯著下降。PB轉(zhuǎn) 座子主要采取"cut-paste"機制發(fā)生轉(zhuǎn)座，在轉(zhuǎn)座片段被切除后不會在原位點留下印跡 (foo化rint)，基因組可W實現(xiàn)切除后精確修復(fù)，在可逆轉(zhuǎn)基因的應(yīng)用中具有重要作用。此 夕F，PB轉(zhuǎn)座酶可塑性高，通過與其它功能蛋白融合或改變轉(zhuǎn)座酶的功能區(qū)域，不僅能夠改變 轉(zhuǎn)座酶的活性和作用方式，也可W提高外源基因轉(zhuǎn)座的祀向性。近年來，通過密碼子優(yōu)化、 特定位點氨基酸定點突變、相應(yīng)核定位標(biāo)簽的引入等，使PB在哺乳動物細胞內(nèi)的整合效率 進一步提高，使得該系統(tǒng)在基因組研究、基因治療、細胞治療、干細胞誘導(dǎo)和誘導(dǎo)后分化等 領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用。
[0006] 傳統(tǒng)的PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)采用供體質(zhì)粒（在外源基因表達框兩端含有可W為PB整合 酶識別的末端重復(fù)序列）和轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒（提供PB轉(zhuǎn)座酶）構(gòu)成的二元轉(zhuǎn)座系統(tǒng)。在該 二元轉(zhuǎn)座系統(tǒng)中，為實現(xiàn)外源基因表達框的有效整合，必須滿足兩個質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染到同一細 胞內(nèi)，運在轉(zhuǎn)染過程中只有一部分細胞能夠?qū)崿F(xiàn)（其它細胞要么一個質(zhì)粒也沒成功轉(zhuǎn)染， 要么只轉(zhuǎn)染了其中一個質(zhì)粒，都不能實現(xiàn)有效整合），一定程度上降低了整合效率。同時，由 于PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)采用完全可逆的"cut-paste"形式發(fā)生，只要整合酶維持表達，其仍具有 將已整合入基因組的外源基因表達框重新剪切掉的可能，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，且實際上降 低了整合效率。
[0007] 因此，為提高PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的整合效率，非常有必要對該載體系統(tǒng)進行 改造，將供體質(zhì)粒與轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒納入同一質(zhì)粒，同時設(shè)置轉(zhuǎn)座酶的自我失活 (Self-inactivating)機制，保證在外源基因?qū)崿F(xiàn)整合后，轉(zhuǎn)座酶的表達能被及時關(guān)閉。有 文獻報道，其中一個策略是將控制PB表達的啟動子放置在外源表達框與其中一個轉(zhuǎn)座酶 ITR之間，一旦外源基因表達框被從質(zhì)粒上切除并整合到基因組，PB表達框?qū)⑷睋p啟動子， 轉(zhuǎn)錄被中止，表達被及時關(guān)閉（UrschitzJ,KawasumiM,OwensIMorozumi!(,Yamashiro H,StoytchevI，MarhJ,DeeJA,KawamotoK,CoatesCJ,KaminskiJM,Pelczar P,Yanagimachi民，MoisyadiS.Helper-independentpiggyBacplasmidsforgene deliveryapproaches:strategiesforavoidingpotentialgenotoxiceffects.Proc NatlAcadSciUSA. 2010:107(18):8117-22.)D然而這種策略的缺陷是，將原先控制 PB基因表達的強啟動子一并整合到基因組中，有可能激活宿主細胞整合位點側(cè)翼基因的表 達，具有潛在的安全風(fēng)險。
[0008] 另一種策略是使PB表達框與外源基因表達框同向放置，并共用同一個化IyA加尾 信號序列，一旦外源基因表達框被從質(zhì)粒上切除并整合到基因組，PB表達框?qū)⑷睋p化IyA 加尾信號序列，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的HiRNA不穩(wěn)定而被快速降解，PB的表達被關(guān)閉（化akraborty S,JiH,ChenJ,GersbachCA,LeongKW.Vectormodificationstoeliminate transposaseexpressionfollowingpiggyBac-mediatedtransgenesis.SciRep. 2014 ； 4:7403)。運種策略的缺陷是，PB基因的表達框所轉(zhuǎn)錄的mRNA產(chǎn)物實際上覆蓋了整個外源 基因表達框序列，如果外源基因表達框較大，將導(dǎo)致其mRNA長度過大，降低PB轉(zhuǎn)錄效率，難 W達到整合所需的PB表達量。
[0009] 一元轉(zhuǎn)座系統(tǒng)需要將外源基因表達框與PB表達框裝入同一載體，但PB的編碼序 列較長，接近沈b，導(dǎo)致質(zhì)粒片段較大，將大幅降低轉(zhuǎn)染效率。
[0010] 另外，目前已有的PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的整合位點傾向于插入編碼基因內(nèi)內(nèi)（Woodard LE,WilsonMH.TrendsBiotechnol.piggyBac-ingmodelsandnewtherapeutic strategies. 2015 ;33 (9) : 525-33.見第4頁表I)。運里所述的編碼基因是相對于非編碼基 因而言，即能編碼產(chǎn)生相應(yīng)功能蛋白質(zhì)的基因；如果是腫瘤相關(guān)基因被插入失活，或者異常 激活，則可能有致癌風(fēng)險。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明人經(jīng)過大量的試驗和創(chuàng)造性的勞動，構(gòu)建了一種基于PiggyBac轉(zhuǎn)座子的 整合型系統(tǒng)，該系統(tǒng)能介導(dǎo)外源基因在宿主細胞內(nèi)高效整合，并高效穩(wěn)定表達。本發(fā)明人驚 奇地發(fā)現(xiàn)，該系統(tǒng)介導(dǎo)的外源基因整合位點主要集中在宿主細胞基因組內(nèi)的3個基因間區(qū) 段，能較大程度上避免隨機插入引發(fā)的風(fēng)險。由此提供了下述發(fā)明：
[0012] 本發(fā)明的一個方面設(shè)及一種核酸構(gòu)建體，其依次包含如下6種元件：
[0013] 轉(zhuǎn)座子5'末端重復(fù)序列、多克隆插入位點、POlyA加尾信號序列、轉(zhuǎn)座子3'末端 重復(fù)序列、轉(zhuǎn)座酶編碼序列W及控制該轉(zhuǎn)座酶表達的啟動子；
[0014] 其中，
[0015] 所述多克隆插入位點用于可操作地插入外源基因編碼序列W及可選的控制外源 基因表達的啟動子；
[0016] 所述polyA加尾信號序列正反向均具有polyA加尾信號功能；
[0017] 所述轉(zhuǎn)座酶的表達框的方向與外源基因表達框的方向相反。
[0018] 在本發(fā)明中，如果沒有特別說明，W外源基因表達框的方向為正向，W轉(zhuǎn)座酶表達 框的方向為反向。
[0019] 上述的"依次包含如下元件"中的"依次"所指的方向和/或順序是指從上游至下 游。在本發(fā)明中，如果沒有特別說明，沿著上述"正向"的方向為從上游至下游，沿著上述"反 向"的方向為從下游至上游。
[0020] 在本發(fā)明的一個實施方案中，上述的6種元件各自獨立地為單拷貝或者多拷貝。
[0021] 上述的6個元件之間可W直接相連接，也可W包含有其它的序列例如連接序列 (linker)或者酶切位點。
[0022] 在本發(fā)明中，如果沒有特別說明，上述的"所述POlyA加尾信號序列正反向均具有 POlyA加尾信號功能"包括但不限于如下的情形：
[0023] 1) -種polyA加尾信號序列，其正反向均具有polyA加尾信號功能；
[0024] 。兩種polyA加尾信號序列，一個正向具有polyA加尾信號功能，一個反向具有 polyA加尾信號功能。
[00巧]優(yōu)選地，采用上面1)中的方案。不拘于理論的限制，運樣外源基因表達框與PiggyBac轉(zhuǎn)座酶表達框可W共用一個polyA加尾信號序列，從而減少了一個polyA加尾信 號序列，體現(xiàn)集約原則，縮小質(zhì)粒大小，有助于在保證轉(zhuǎn)染效率的前提下，增加外源基因表 達框的容量。
[0026] 本發(fā)明另外一個非優(yōu)選的技術(shù)方案中，PB表達框與外源基因表達框同向放置，用 兩個polyA加尾信號序列，其中PB的表達框在前，其polyA加尾信號序列放在其中一個口R 與外源基因啟動子之間。例如：控制PB轉(zhuǎn)座酶表達的啟動子、PB轉(zhuǎn)座酶編碼序列、轉(zhuǎn)座子 5'末端重復(fù)序列、POlyA加尾信號序列1、外源基因啟動子和外源基因（多克隆插入位點）、 POlyA加尾信號序列2、轉(zhuǎn)座子3'末端重復(fù)序列；并且PB轉(zhuǎn)座酶的表達框的方向與外源基 因表達框的方向相同。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明任一項所述的核酸構(gòu)建體，其中，所述轉(zhuǎn)座子5'末端重復(fù)序列與所述 轉(zhuǎn)座子3'末端重復(fù)序列的位置能夠互換。
[002引根據(jù)本發(fā)明任一項所述的核酸構(gòu)建體，其中，
[0029] 所述轉(zhuǎn)座子5'末端重復(fù)序列為PiggyBac轉(zhuǎn)座子5'末端重復(fù)序列；所述轉(zhuǎn)座子3' 末端重復(fù)序列為PiggyBac轉(zhuǎn)座子3'末端重復(fù)序列；所述轉(zhuǎn)座酶為PiggyBac轉(zhuǎn)座酶。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明任一項所述的核酸構(gòu)建體，其中
[0031] 所述PiggyBac轉(zhuǎn)座子5'末端重復(fù)序列的核巧酸序列如SEQIDNO: 1所示；和/ 或所述PiggyBac轉(zhuǎn)座子3'末端重復(fù)序列的核巧酸序列如SEQIDNO:4所示。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明任一項所述的核酸構(gòu)建體，其中，
[0033] 所述PiggyBac轉(zhuǎn)座酶的氨基酸序列如SEQIDNO: 17所示；優(yōu)選地，所述PiggyBac 轉(zhuǎn)座酶的編碼核巧酸序列如SEQIDNO:5所示。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明任一項所述的核酸構(gòu)建體，其中，
[0035] 所述轉(zhuǎn)座酶編碼序列含有或者可操作地連接單拷貝或者多拷貝的核定位信號編 碼序列；優(yōu)選為c-myc核定位信號編碼序列，例如為SEQIDNO: 18所示的序列。核定位信 號能夠引導(dǎo)轉(zhuǎn)座酶在細胞核聚集，從而提高了轉(zhuǎn)座效率。
[0036] 根據(jù)本發(fā)明任一項所述的核酸構(gòu)建體，其特征在于如下的（1)-(3)項中的任意一 項或者多項：
[0037] (1)所述多克隆插入位點的核巧酸序列如SEQIDN0:2所示；
[0038] (2)所述POlyA加尾信號序列的核巧酸序列如SEQIDNO: 3所示；
[0039] SEQIDNO: 3所示的序列正反向均具有polyA加尾信號功能。
[0040] 做所述啟動子選自和CMV啟動子（例如，如SEQIDN0:6所示）、EF1a啟動子、 SV40啟動子、UbiquitinB啟動子、CAG啟動子、服P70啟動子、PGK-I啟動子、0 -actin啟 動子、TK啟動子和GRP78啟動子。
[0041] 根據(jù)本發(fā)明任一項所述的核酸構(gòu)建體，其多克隆位點可操作地插入有一個或多個 相同或不同的外源基因W及可選的控制外源基因表達的啟動子，或者其多克隆位點被替換 為一個或多個相同或不同的外源基因編碼序列W及可選的控制外源基因表達的啟動子；所 述外源基因獨立地為單拷貝或多拷貝；
[0042] 具體地，所述外源基因選自巧光素報告基因（例如綠色巧光蛋白、紅色巧光蛋白、 黃色巧光蛋白等）、巧光素酶基因（例如蛋火蟲巧光素酶、海腎巧光素酶等）、天然功能蛋白 基因（例如TP53、GM-CSF、0CT4、S0X2、化nog、KLF4、C-Myc)、RNAi基因W及人工嵌合基因 (例如嵌合抗原受體基因如CAR19、Fc融合蛋白基因、全長抗體基因）中的一種或多種； [004引具體地，所述外源基因的序列如SEQIDN0:9-ll或16中的任意一個或者多個序 列所示。
[0044] 本發(fā)明的再一方面設(shè)及一種重組載體，其含有本發(fā)明中任一項所述的核酸構(gòu)建 體；
[0045] 具體地，所述重組載體為重組克隆載體、重組真核表達質(zhì)粒或者重組病毒載體；
[0046] 具體地，所述重組克隆載體為本發(fā)明中任一項所述的核酸構(gòu)建體與pUC18、pUC19、 pMDlS-T、PMD19-T、pGM-T載體、pUC57、pMAX或PDC315系列載體經(jīng)重組得到的重組載體；
[0047] 具體地，所述重組表達載體為本發(fā)明中任一項所述的核酸構(gòu)建體與PCDNA3系列 載體、PCDNA4系列載體、PCDNA5系列載體、PCDNA6系列載體、P化系列載體、PUC57載體、 pMAX載體或PDC315系列載體經(jīng)重組得到的重組載體；
[0048] 具體地，所述重組病毒載體為重組腺病毒載體、重組腺相關(guān)病毒載體、重組逆轉(zhuǎn)錄 病毒載體、重組單純瘤疹病毒載體或重組痘苗病毒載體。
[0049] 本發(fā)明的再一方面設(shè)及一種重組宿主細胞，其含有本發(fā)明中任一項所述的核酸構(gòu) 建體或者本發(fā)明的重組載體；具體地，所述重組宿主細胞為重組的哺乳動物細胞；例如重 組的原代培養(yǎng)T細胞、化rkat細胞、K562細胞、胚胎干細胞、腫瘤細胞、肥K293細胞或CHO 細胞。
[0050] 本發(fā)明的再一方面設(shè)及本發(fā)明中任一項所述的核酸構(gòu)建體、本發(fā)明的重組載體或 者本發(fā)明的重組宿主細胞的用途，其選自如下的（1)-(4