微小rna的實(shí)時(shí)恒溫指數(shù)擴(kuò)增方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，是一種可同時(shí)定性和/或定量檢測(cè)一種或多種微小RNA(microRNA，miRNA)的實(shí)時(shí)恒溫指數(shù)擴(kuò)增方法。
【背景技術(shù)】
[0002]與基因組DNA、mRNA和長片段非編碼RNA (IncRNA)等核酸分子相比較，微小RNA(microRNA, miRNA)分子具有其特殊性，如:核酸分子片段極小(< 22nt)，GC含量分布廣泛(5?95% )，導(dǎo)致恪解溫度(melting temperature, Tm)差異大，難于設(shè)計(jì)匹配的擴(kuò)增引物和檢測(cè)探針；所占總RNA的比例極低(< 0.01% )，需要高靈敏度的檢測(cè)方法；家族分子差異小(可僅有單堿基差異)，對(duì)檢測(cè)特異性的要求高；不同miRNA的表達(dá)水平差異極大(可達(dá)4個(gè)數(shù)量級(jí)；如:幾十個(gè)拷貝/細(xì)胞至5 X 15拷貝/細(xì)胞)，要求檢測(cè)線性范圍寬，同時(shí)能夠有效識(shí)別低豐度miRNA ;革[1序列同時(shí)存在于pr1-miRNA和pre-miRNA中；缺乏類似于mRNA的poly(A)尾，使其難以用常規(guī)技術(shù)手段進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄檢測(cè)。miRNA的上述特征對(duì)其核酸分子檢測(cè)技術(shù)和方法提出了近乎于苛刻的特殊需求。例如，極小的分子片段使常規(guī)PCR引物設(shè)計(jì)策略無法實(shí)施，單堿基差異對(duì)引物或探針的堿基分辯能力要求極高，GC含量的巨大差異導(dǎo)致引物和探針難于取向于均一的退火溫度。
[0003]自1993年首次發(fā)現(xiàn)miRNA以來，miRNA的檢測(cè)方法從Northern Blot探針雜交法逐漸向高通量測(cè)序法(如=Solexa法和SoLiD法等)、芯片雜交法、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridizat1n, ISH)、實(shí)時(shí)焚光逆轉(zhuǎn)錄定量 PCR 法(real-timereverse transcript1n quantitative PCR, RT-qPCR)、恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)發(fā)展。由于miRNA靶分子的上述獨(dú)特屬性，現(xiàn)有的每種檢測(cè)技術(shù)和方法特點(diǎn)各異，各有所長，但也都有明顯的缺點(diǎn)，從而使每種方法都有其最適合的使用環(huán)境。
[0004]以目前最常用的基于芯片雜交法的微陣列技術(shù)、高通量測(cè)序法和RT-qPCR為例。高通量測(cè)序與微陣列的檢測(cè)通量大，并且，高通量測(cè)序還可用于發(fā)現(xiàn)新miRNA，但是，這兩種方法的定量精確性較差，價(jià)格昂貴，一般應(yīng)用于miRNA的初篩研究。此外，高通量測(cè)序技術(shù)文庫制備復(fù)雜，達(dá)到兆字節(jié)(terabytes, TB)的龐大和復(fù)雜文庫數(shù)據(jù)分析需要特殊的計(jì)算機(jī)資源和相關(guān)的生物信息學(xué)工具和手段，因此，往往由專業(yè)的公司提供。由于miRNA的片段小，且Tm值差異大，微陣列技術(shù)不能簡單地通過增加和減少探針的長度來均衡不同探針的雜交效率，因此，往往需要借助一些特殊的技術(shù)手段，例如使用鎖核酸探針(lockednucleic acid, LNA)。以莖環(huán)引物 RT-qPCR、poly (T)接頭 RT-qPCR 為代表的 RT-qPCR 技術(shù)是驗(yàn)證基因組水平miRNA表達(dá)譜研究結(jié)果最常用和最經(jīng)典的方法，但是該技術(shù)均需逆轉(zhuǎn)錄步驟，受多種因素制約的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)歸一化對(duì)檢測(cè)結(jié)果精確度影響大，“熱變性-復(fù)性-延伸”熱循環(huán)條件需要高純度的miRNA，此外，擴(kuò)增效率受到多種因素的影響和制約，易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增；擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間長，一般需要幾個(gè)小時(shí)；受限于熱動(dòng)力學(xué)特征，無法精確檢測(cè)2倍以下的表達(dá)差異。
[0005]理想的miRNA檢測(cè)方法應(yīng)當(dāng)具有以下特征:靈敏度高，能夠達(dá)到檢測(cè)少量或微量起始材料；特異性好，能夠識(shí)別僅有單堿基差異的miRNA ;操作簡便，無需昂貴的試劑和設(shè)備；通用性高，能夠應(yīng)用于miRNA的組織和細(xì)胞原位檢測(cè)、高通量檢測(cè)、精確定量檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域。但是，如上所述，受限于miRNA靶分子的特有屬性及現(xiàn)有技術(shù)的固有局限性，miRNA的現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)往往只能滿足上述部分需求。如果能夠研發(fā)出一種新的能夠更好地滿足上述需求的技術(shù)和方法，一方面，能夠得到更廣泛的應(yīng)用，例如，采用一種技術(shù)和方法就能實(shí)現(xiàn)多個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用，從而有效地拓展非編碼RNA (non-coding RNA, ncRNA)的研究深度與廣度。
[0006]恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是溫度基本不變的核酸擴(kuò)增技術(shù)。相對(duì)于以PCR為代表的變溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有以下主要優(yōu)勢(shì):反應(yīng)溫度單一，對(duì)設(shè)備的要求程度低；不存在溫度變化，擴(kuò)增效率及核酸擴(kuò)增片段長度均優(yōu)于常規(guī)PCR技術(shù)；反應(yīng)時(shí)間短，可在I小時(shí)，甚至幾分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)靶分子的有效擴(kuò)增，且靈敏度和特異性與PCR技術(shù)相當(dāng)，甚至更好。上述技術(shù)優(yōu)勢(shì)使恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，并且，特別適合于miRNA的檢測(cè)。
[0007]目前，已經(jīng)發(fā)展出了多種核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其中，具有代表性的技術(shù)主要包括:鏈置換擴(kuò)增(strand displacement amplificat1n, SDA)、環(huán)介導(dǎo)核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplificat1n, LAMP)、滾環(huán)擴(kuò)增(rollingcircle amplificat1n, RCA)、依賴于核酸序列的擴(kuò)增(nucleic acid sequence-basedamplificat1n, NASBA)、依賴于解旋酶的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(helicase-dependentisothermal DNA amplificat1n, HAD)、車專錄介導(dǎo)擴(kuò)增(transcript1n-mediatedamplificat1n, TMA)n 單引物等溫?cái)U(kuò)增(single primer isothermalamplificat1n, SPIA)、信號(hào)介導(dǎo) RNA 擴(kuò)增技術(shù)(signal mediated amplificat1n of RNAtechnology, SMART)、恒溫指數(shù)擴(kuò)增(exponential amplificat1n react1n ;EXPAR)。但是，由于miRNA靶分子的特殊性，僅有部分恒溫技術(shù)適合于miRNA的檢測(cè)，例如SDA、RCA和EXPAR0但是，受限于現(xiàn)有恒溫技術(shù)的技術(shù)局限性，現(xiàn)有的miRNA恒溫檢測(cè)技術(shù)往往只能檢測(cè)單一 miRNA靶分子，無法實(shí)現(xiàn)多個(gè)或高通量miRNA的檢測(cè)。
[0008]無論是變溫還是恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，DNA聚合酶均是其反應(yīng)體系的必需酶。一般而言，DNA聚合酶通常具有以下一種或多種生物學(xué)功能:5’ 一 3’擴(kuò)增活性(amplificat1nactivities)、5’ 一3’ 核酸外切酶活性(exonuclease activities)、3’ 一5’ 核酸外切酶活性、鏈置換活性(strand displacement activities) ο
[0009]無論是變溫還是恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，在引物延伸過程中，當(dāng)其3’ -延伸末端抵達(dá)下游DNA鏈，即其3’ -延伸末端存在另一條與模板分子互補(bǔ)配對(duì)形成的雙鏈DNA (double strandDNA, dsDNA)區(qū)域時(shí)，如果DNA聚合酶既不具備5’ 一3’外切酶活性，也不具備鏈置換活性，那么，引物的3’ -末端延伸則受到下游DNA鏈的阻止而無法繼續(xù)延伸。但是，當(dāng)DNA聚合酶具有5’ 一 3’外切酶活性時(shí)(如:Taq DNA聚合酶)，該活性可將下游DNA鏈按照5’ 一 3’方向水解成單核苷酸，從而使引物的延伸得以繼續(xù)，如實(shí)時(shí)熒光PCR中的水解探針技術(shù)；或者，當(dāng)DNA聚合酶具有鏈置換活性時(shí)(如:Bst DNA聚合酶)，該活性可以使引物的延伸得以繼續(xù)，同時(shí)，將下游DNA鏈從dsDNA區(qū)域剝離，使下游DNA鏈變成游離的單鏈核酸分子。DNA聚合酶的上述鏈置換活性被廣泛應(yīng)用于多種恒溫?cái)U(kuò)增系統(tǒng)，如SDA、LAMP、RCA等。
[0010]具有鏈置換活性、缺乏5’ 一 3’外切酶活性的DNA聚合酶被廣泛應(yīng)用于依賴雙鏈核酸分子缺口的鏈置換反應(yīng)。所謂雙鏈核酸分子缺口是指雙鏈核酸分子的一條鏈保持完整性，另一條鏈的某兩個(gè)毗鄰核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂，從而形成一個(gè)缺口。該缺口兩側(cè)的核酸分子末端分別是3’ -端輕基(3，-hydroxy group, 3’ -OH)和5’ -端磷酸基團(tuán)(5’ -phosphate group, 5’ -P04)。在上述DNA聚合酶存在的作用下，具有3’ -OH的核酸分子從缺口處3’-OH開始延伸反應(yīng)，同時(shí)，其延伸合成的新生核酸鏈將下游的舊鏈剝離，使下游舊鏈轉(zhuǎn)變成游離的單鏈核酸分子。
[0011]缺口內(nèi)切酶(nicking endonuclease)，亦叫缺口酶(nicking enzyme)，是 II 型限制性內(nèi)切酶(restrict1n endonuclease)中的一類特殊類型酶。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)280余種缺口酶，商品化的近20余種，并且，其熱穩(wěn)定性到可達(dá)到65°C或更高。該類酶只切割雙鏈核酸分子中的一條鏈，造成一個(gè)雙鏈核酸分子缺口，該缺口兩側(cè)的核酸分子末端分別是3’ -OH和5’ -P04。完全或部分雙鏈核酸分子中被缺口內(nèi)切酶識(shí)別的核苷酸序列被稱為缺口內(nèi)切酶識(shí)別序列(nicking endonuclease recognit1n sequences, NERS) ο
[0012]限制性內(nèi)切酶中還有一種特殊類型的酶(如=HincII)，該類酶具有常規(guī)限制性內(nèi)切酶的功能，能夠識(shí)別并在天然雙鏈核酸分子的限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列(restrict1nendonuclease recognit1n sequences, RERS)處同時(shí)酶切雙鏈核酸分子的兩條鏈。但是，當(dāng)雙鏈核酸分子中的一條鏈在RERS序列中至少含有一個(gè)衍生核苷酸(如:α巰基-脫氧核苷酸(α-th1 deoxynucleotide)時(shí)，該衍生核苷酸可阻止限制性內(nèi)切酶切割該核酸分子鏈，因此，只能切割另一條不含有衍生核苷酸的天然核酸分子鏈。這種僅有一條鏈的RERS序列含有阻止限制性內(nèi)切酶切割的雙鏈核酸分子被稱為半修飾RESR?？梢?，能夠識(shí)別并切割半修飾RERS的限制性內(nèi)切酶具有與缺口內(nèi)切酶相似的功能，即可用于制備雙鏈核酸分子缺口。
[0013]缺口內(nèi)切酶及可識(shí)別半切割半修飾RESR的限制性內(nèi)切酶的上述生物學(xué)活性被廣泛應(yīng)用于依賴雙鏈核酸分子缺口的鏈置換反應(yīng)，并且，該鏈置換反應(yīng)原理被廣泛應(yīng)用于多種恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，如SDA、EXPAR等。例如，在缺口內(nèi)切酶(或:可識(shí)別半切割半修飾RESR的限制性內(nèi)切酶)和具有鏈置換活性DNA聚合酶的共同作用下，具有3’ -OH的核酸分子從缺口處3’-OH開始延伸反應(yīng)，同時(shí)，其延伸合成的新生核酸鏈將下游的舊鏈剝離。因鏈延伸而被封閉的缺口可以在缺口內(nèi)切酶(或:可識(shí)別半切割半修飾RESR的限制性內(nèi)切酶)的作用下重復(fù)產(chǎn)生，從而使得“切割-延伸-鏈置換”的過程能夠重復(fù)進(jìn)行，并在此過程中，以線性或指數(shù)方式不斷剝離或釋放出與下游舊鏈序列相同的單鏈核酉愛分子(Walker GT, et al.Strand displacement amplificat1n—an isothermal, invitro DNA amplificat1n technique.Nucleic Acids Res.1992 ；20(7):1691-6.Walker GT, et al.Strand displacement amplificat1n—an isothermal, in vitro DNAamplificat1n technique.Nucleic Acids Res.1992 ；20 (7):1691-6.Van Ness J, etal.1sothermal react1ns for the amplificat1n of oligonucleotides.Proc NatlAcad Sci USA.2003 ; 100 (8):4504-9.Shi C, et al.Exponential strand-displacementamplificat1n for detect1n of microRNAs.Anal Chem.2014 ;86 (I):336-9)。
[0014]鎖核酸(locked nucleid acid, LNA) —種特殊的雙環(huán)狀寡核苷酸衍生物，其核糖的β -D-呋喃核糖的2’ -O和4’ -C通過不同的縮水作用形成氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋，并連接成環(huán)形，這個(gè)環(huán)形橋鎖定了呋喃糖C3’-內(nèi)型的N構(gòu)型，降低了核糖結(jié)構(gòu)的柔韌性，增加了磷酸鹽骨架局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。由于LNA與DNA/RNA在結(jié)構(gòu)上具有相同的磷酸鹽骨架，故其對(duì)DNA、RNA有很好的識(shí)別能力和強(qiáng)大的親和力。與其他寡核苷酸類似物相比，DNA/LNA嵌合式寡核苷酸對(duì)單堿基變異具有良好的識(shí)別能力，以DNA/LNA嵌合引物或探針形式廣泛應(yīng)用于多種分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)中。
[0015]由上可見，如果有效整合缺口酶、具有鏈置換活性DNA聚合酶和熒光標(biāo)記DNA/LNA嵌合引物的協(xié)同作用優(yōu)勢(shì)，就能夠在較高單一恒定溫度條件下通過“切割-延伸-鏈置換”自主鏈?zhǔn)窖h(huán)實(shí)現(xiàn)靶分子的指數(shù)擴(kuò)增，則能為解決miRNA現(xiàn)有技術(shù)瓶頸，實(shí)現(xiàn)miRNA的床旁快速檢測(cè)提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種基于寡核苷酸引物的恒溫?cái)U(kuò)增系統(tǒng)，該系統(tǒng)可在恒定溫度條件下，能夠在單一恒定溫度條件下通過“切割-延伸-鏈置換”自主鏈?zhǔn)窖h(huán)實(shí)現(xiàn)靶分子指數(shù)擴(kuò)增的微小RNA實(shí)時(shí)恒溫指數(shù)擴(kuò)增方法。
[0017]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:miRNA的實(shí)時(shí)恒溫指數(shù)擴(kuò)增方法，反應(yīng)混合物包括以下反應(yīng)成分:
[0018]①具有3’ -端羥基的miRNA靶分子；
[0019]②上游引物和下游引物；
[0020]③DNA聚合酶；
[0021]④識(shí)別上游引物和下游引物缺口劑識(shí)別序列的缺口劑；
[0022]⑤三磷酸脫氧核苷酸；<