一種軍團(tuán)菌快速檢測與分型的引物及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物分子檢測領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種軍團(tuán)菌快速檢測與分型的引物及 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 軍團(tuán)菌是一種胞內(nèi)寄生的革蘭陰性桿菌，在±壤和水系統(tǒng)中廣泛存在。目前軍團(tuán) 菌屬有52種包括70多個血清型，并不斷有新的菌種從環(huán)境中分離。近年來發(fā)現(xiàn)，約有一半 的軍團(tuán)菌種與人類疾病有關(guān)，其中80%W上的軍團(tuán)菌感染是由嗜肺軍團(tuán)菌引起。軍團(tuán)菌通 過空氣W氣溶膠的形式感染人，引起軍團(tuán)菌性肺炎，嚴(yán)重威脅人類的健康。因此，建立一種 能檢測軍團(tuán)菌和快速鑒別嗜肺軍團(tuán)菌與非嗜肺軍團(tuán)菌的方法具有重要的臨床意義。
[0003]目前對軍團(tuán)菌的檢測鑒定方法主要有血清抗體檢測、尿可溶性抗原檢測、軍團(tuán)菌 分離培養(yǎng)等。但是上述的檢測方法存在檢測時間長、陽性率低、培養(yǎng)基的配置復(fù)雜和價格昂 貴的缺陷，不利于軍團(tuán)菌的快速檢測。近年來，分子生物學(xué)的發(fā)展為微生物的分類鑒定工作 提供了較簡便和準(zhǔn)確的方法。PCR方法具有很高的特異性與敏感性，其主要是通過檢測軍 團(tuán)菌中的特異基因，W達(dá)到快速檢測軍團(tuán)菌的目的。
[0004] 中國專利申請201410607389. 6公開了一種快速區(qū)分非嗜肺、嗜肺與嗜肺I型軍團(tuán) 菌的S重PCR檢測方法，所述檢測方法主要是針對軍團(tuán)菌種屬、嗜肺軍團(tuán)菌種和嗜肺軍團(tuán) 菌I型的leSrRNA、danl和0RF9S個基因的引物，對dNTPs和引物濃度比例W及退火溫度 進(jìn)行優(yōu)化，建立快速區(qū)分非嗜肺、嗜肺與嗜肺I型軍團(tuán)菌的S重PCR方法，該檢測方法可W 對分離培養(yǎng)到的可疑軍團(tuán)菌菌株進(jìn)行快速有效的判定。但是，該檢測方法只對可疑軍團(tuán)菌 菌株進(jìn)行分型，而且是利用了=個基因祀點，檢測范圍較狹窄，特異性不強，不利于該檢測 方法的推廣和應(yīng)用。
[0005] 中國專利CN101717815B公開了一種軍團(tuán)菌快速檢測與分型方法，該方法是W基 因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，對檢測出陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切 反應(yīng)，對酶切反應(yīng)產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳分析進(jìn)行分子分型。該檢測方法能夠檢測出軍團(tuán) 菌，且能將其分子分型為嗜肺軍團(tuán)菌或非嗜肺軍團(tuán)菌。但是，該檢測方法的軍團(tuán)菌分型需要 進(jìn)行多次瓊脂糖凝膠電泳分析，操作比較繁瑣，大大限制了該檢測方法的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中軍團(tuán)菌的檢測方法存在檢測范圍窄、操作繁瑣的缺陷，本發(fā)明 提供一種軍團(tuán)菌快速檢測與分型的引物及方法，W解決上述問題。
[0007] 本發(fā)明提供一種軍團(tuán)菌快速檢測與分型的引物，其包括軍團(tuán)菌屬特異引物和嗜肺 軍團(tuán)菌16srRNA基因單核巧酸多態(tài)性位點特異引物，所述軍團(tuán)菌屬特異引物為： GL261F:5, -GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3,（SEQIDNO. 1)， GL261R:5, -CGATCTCTACGCATTTCACCG-3'(SEQIDNO. 2); 所述嗜肺軍團(tuán)菌16srRNA基因單核巧酸多態(tài)性位點特異引物為： LP-A62Sr:5，-GTCAACCAGTATTATCTGACCGT-3,（SEQIDNO. 3)， LP-C629f:5' -CTGGGCTTMCCTGGGAC-3'(沈QIDNO. 4)。
[0008] 進(jìn)一步地，所述軍團(tuán)菌屬特異引物與嗜肺軍團(tuán)菌16srRNA基因單核巧酸多態(tài)性位 點特異引物的濃度比為1-3 :1-3,所述軍團(tuán)菌屬特異引物與嗜肺軍團(tuán)菌16srRNA基因單核 巧酸多態(tài)性位點特異引物的濃度比優(yōu)選為2 :1。
[0009] 進(jìn)一步地，所述軍團(tuán)菌屬特異引物和嗜肺軍團(tuán)菌16srRNA基因單核巧酸多態(tài)性位 點特異引物的祀基因為16SrRNA基因。
[0010] 另外，本發(fā)明還提供了一種軍團(tuán)菌快速檢測與分型的方法，包括如下步驟： Sl應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA提取液提取待測標(biāo)本中的細(xì)菌基因組DNA; S2W細(xì)菌基因組DNA為模板，采用權(quán)利要求1所述的軍團(tuán)菌屬特異引物和嗜肺軍團(tuán)菌 16srRNA基因單核巧酸多態(tài)性位點特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增； S3將陽性對照和陰性對照進(jìn)行PCR擴(kuò)增； S4將所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。
[0011] 進(jìn)一步地，所述步驟Sl中細(xì)菌基因組DNA提取液的配方為：化elex100resin 5〇/〇;化13-肥11〇1111，口冊.3;乙二胺四乙酸二鋼0.11111;疊氮鋼0.1%;蛋白酶1( 200 ^邑/ mlO
[0012] 進(jìn)一步地，所述步驟S2中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括：階段I:94°C3min;階段2 : 94°C20s;階段3:59°C20s;階段4:72°C25s;35個循環(huán)；階段5:72°C5min;在4°C保溫。
[0013] 進(jìn)一步地，所述步驟S2中軍團(tuán)菌屬特異引物擴(kuò)增序列為26化p。其中， 化261F-GL261R引物對擴(kuò)增序列為軍團(tuán)菌屬16SrDNA基因一段保守序列，具體序列如下： GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGCTGATTAACTGGACGTTACCCACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCC AGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGTGGTTGATTA AGTTATCTGTGAAATTCCTGGGCTTAACCTGGGACGGTCAGATAATACTGGTTGACTCGAGTATGGGAGAGGGTAGT GGAATTTCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCG。
[0014] 進(jìn)一步地，所述步驟S2中肺軍團(tuán)菌16srRNA基因單核巧酸多態(tài)性位點特異引物 分別與軍團(tuán)菌屬特異引物配對擴(kuò)增26化P內(nèi)的一段序列；化261F- (LP-A628R)引物對擴(kuò)增 片段為203bp; (LP-C629F) -GL261R引物對擴(kuò)增序列為97bp。其中，化261F- (LP-A628R)引 物對擴(kuò)增片段亦為軍團(tuán)菌屬16SrDNA基因一段保守序列為上述26化P片段內(nèi)的一段203bp 序列，具體序列如下： GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGCTGATTAACTGGACGTTACCCACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCC AGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGTGGTTGATTA AGTTATCTGTGAAATTCCTGGGCTTAACCTGGGACGGTCAGATAATACTGGTTGAC； (LP-C629F)-GL261R引物對擴(kuò)增序列亦為軍團(tuán)菌屬16SrDNA基因一段保守序列為上述 261BP片段內(nèi)的一段97bp序列，具體序列如下： CTGGGCTTAACCTGGGACGGTCAGATAATACTGGTTGACTCGAGTATGGGAGAGGGTAGTGGAATTTCCGGTG TAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCG〇
[0015] 進(jìn)一步地，所述步驟S3中陽性對照包含嗜肺軍團(tuán)菌基因組DNA、軍團(tuán)菌屬特異引 物和嗜肺軍團(tuán)菌16srRNA基因單核巧酸多態(tài)性位點特異引物，所述軍團(tuán)菌基因組DNA核巧 酸序列在NCBI基因庫上編號為NR_074231。
[0016] 更進(jìn)一步地，所述步驟S3中陰性對照包含軍團(tuán)菌屬特異引物和嗜肺軍團(tuán)菌16s rRNA基因單核巧酸多態(tài)性位點特異引物。
[0017] 本發(fā)明提供的軍團(tuán)菌快速檢測與分型的方法是利用等位基因特異性PCR原理，利 用等位基因上一兩個堿基的差異，特異擴(kuò)增其中一個等位基因的技術(shù)。其主要原理是利用 一對特異與其中一條等位基因完全互補的引物，而與另外一條等位基因在3'端不互補的引 物進(jìn)行基因擴(kuò)增，從而達(dá)到鑒別的效果。發(fā)明人經(jīng)過生物信息學(xué)方法的研究發(fā)現(xiàn)軍團(tuán)菌屬 16srRNA基因里有一段保守序列中存在兩個單核甘酸多態(tài)性位點（SNP)，該位點在嗜肺軍 團(tuán)菌中為A62SC629,而在非嗜肺軍團(tuán)菌中的單核甘酸多態(tài)性位點（SNP)貝懷是A62SC629,因此利 用一對軍團(tuán)菌屬特異引物和一對肺軍團(tuán)菌16srRNA基因單核巧酸多態(tài)性位點特異引物做 多重PCR可W快速檢測軍團(tuán)菌屬，同時還可W鑒別出軍團(tuán)菌是嗜肺軍團(tuán)菌還是非嗜肺軍團(tuán) -tt： 園O
[0018] 本發(fā)明提供的軍團(tuán)菌快速檢測與分型方法的結(jié)果判定方法是：對PCR產(chǎn)物的瓊 脂糖凝膠電泳結(jié)果進(jìn)行分析，若出現(xiàn)261bp條帶，則說明檢測標(biāo)本中含有軍團(tuán)菌屬細(xì)菌，反 么則說明檢測標(biāo)本中不含軍團(tuán)菌屬細(xì)菌；若除了出現(xiàn)26化P條帶外還同時出現(xiàn)了 203bp和 97bp條帶，則說明檢出的軍團(tuán)菌為嗜肺軍團(tuán)菌，若除了 261bp條帶，沒有同時出現(xiàn)203bp和 97bp條帶，則說明檢測到的軍團(tuán)菌為非嗜肺軍團(tuán)菌。
[0019] 本發(fā)明提供軍團(tuán)菌快速檢測與分型的方法不僅能在臨床中應(yīng)用，還可W應(yīng)用于環(huán) 境水標(biāo)本中，為環(huán)境水源風(fēng)險性控制及軍團(tuán)菌感染流行病學(xué)調(diào)查提供依據(jù)和工具，有利于 該檢測方法的推廣和應(yīng)用。
[0020] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供的軍團(tuán)菌快速檢測與分型的 引物具有特異性好和準(zhǔn)確性高的優(yōu)點，提高了檢測效率。此外，本發(fā)明還提供軍團(tuán)菌快速檢 測與分型的方法，通過使用本發(fā)明提供的特異性的引物，可W快速、簡便的檢測出軍團(tuán)菌， 同時還可W進(jìn)一步分型為嗜肺軍團(tuán)菌和非嗜肺軍團(tuán)菌，該檢測方法無需進(jìn)行多次凝膠電泳 分析，操作簡便，而且檢測結(jié)果準(zhǔn)確，是一種理想的軍團(tuán)菌快速檢測與分型的方法。
【附圖說明】
[0021] 圖1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖；其中：Marker條帶；從下到上分別為：100bp、 200bp、300bp、400bp、500bp和600bp，1-4分別為各個不同的菌種鑒定結(jié)果，PC為陽性對 照，NC為陰性對照。
【具體實施方式】
[0022] W上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定 本發(fā)明的具體實施只局限于運些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可W做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。其中，Qielex100resin購買自bio-rad公司（貨號：1432832)。
[002引實施例1、引物 本發(fā)明提供一種軍團(tuán)菌快速檢測與分型的引物。
[0024]表1本發(fā)明提供的引物
實施例2、引物的配對及其擴(kuò)增片