一種用于篩選水稻靶向基因編輯植株的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本項(xiàng)發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種用于篩選水稻祀向基因編輯植株 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在現(xiàn)代生物學(xué)研究中，基因組編輯（Genomicediting,G巧技術(shù)是人們了解和改良 基因功能的重要技術(shù)手段?；蚪M編輯技術(shù)的發(fā)展先后經(jīng)歷了鋒指核酸酶狂incfinger nucleases,ZFNs)技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（Transcriptionactivatorlike effectornucleases,TALENs)技術(shù)、和規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)blusteredregularly interspacedshortpalindromicrepeat,CRISPR)/Cas(CRISPR-assoicated)技術(shù)。運(yùn)些 人工核酸酶都可W在DNA祀位點(diǎn)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂值oublestrandbreaks,DSBs)，然后 利用生物本身?yè)碛械姆峭茨┒诉B接或同源重組兩種不同的修復(fù)機(jī)制對(duì)DSBs進(jìn)行修復(fù)， 實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的定點(diǎn)編輯。
[0003] 其中，CRISPR/Cas系統(tǒng)是近兩年來(lái)剛剛興起但表現(xiàn)為最有應(yīng)用前景的一項(xiàng)基因組 編輯（Genomicediting,GE)技術(shù)，它具有操作簡(jiǎn)便、效率高等特點(diǎn)，已在擬南芥、煙草、水 稻、高梁等植物中成功實(shí)現(xiàn)祀向誘變（參見：NucleicAcidsRes，2013,41(20):el88;rfet Biotech, 2013, 31 (8) :688 - 691 ;化tBiotech, 2013, 31 (8) :691 - 693)。其原理是利用祀點(diǎn) 特異性的RNA將化s9核酸酶引導(dǎo)到基因組上的具體祀點(diǎn)，從而對(duì)特定基因位點(diǎn)進(jìn)行切割導(dǎo) 致突變。利用CRISPR/tas技術(shù)進(jìn)行基因編輯有特異性、祀向性、可遺傳性等優(yōu)勢(shì)。
[0004] 因?yàn)橹参锖蛣?dòng)物的細(xì)胞構(gòu)造不同，植物有細(xì)胞壁，不能通過顯微注射的方法獲得 基因編輯植株，需要農(nóng)桿菌介導(dǎo)。W水稻為例，由CRISPR/Cas技術(shù)獲得基因編輯的植株步 驟是：設(shè)計(jì)兩條單鏈OligO序列，退火形成雙鏈DNA;將雙鏈DNA連接到載體中，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿 菌；農(nóng)桿菌侵染水稻愈傷組織；愈傷組織分化長(zhǎng)成待測(cè)植株。
[00化]CRISPR技術(shù)可W在目標(biāo)區(qū)段內(nèi)引起不同類型的基因突變，多數(shù)為化P插入和小片 段缺失W及一個(gè)或多個(gè)堿基SNP(參見PNAS，2014, 111(12) :4632-4637)。在利用CRISPR/ Cas技術(shù)編輯產(chǎn)生的水稻突變?nèi)后w中，有不同比例的單株出現(xiàn)不同狀態(tài)的突變，如：嵌合 體、雜合型、雙等位基因突變、純合型，不同類型突變植株的情況不同，因此需要采用特定的 方法對(duì)單株進(jìn)行鑒別。
[0006]目前，對(duì)單株進(jìn)行鑒別的方法，主要包括有：祀位點(diǎn)直接PCR后TA克隆測(cè)序和基于 可W識(shí)別錯(cuò)配雙鏈的錯(cuò)配內(nèi)切酶檢測(cè)法?？寺y(cè)序的方法是將祀序列PCR擴(kuò)增后，把PCR 產(chǎn)物克隆到T載體中然后進(jìn)行sanger測(cè)序，經(jīng)測(cè)序后可W確切知道運(yùn)條祀序列上的堿基 變化?？寺y(cè)序法靈敏度高，但是相比之下價(jià)格貴，時(shí)間長(zhǎng)，一般的做法是把篩選出的陽(yáng)性 植株進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。錯(cuò)配酶法的原理是祀序列經(jīng)化s/gRNA切割后由于缺乏修復(fù)模板，將 主要W非同源重組的方式進(jìn)行修復(fù)，或多或少會(huì)插入或刪除一些堿基。因此將祀序列PCR 擴(kuò)增后經(jīng)變性、退火，將形成錯(cuò)配，錯(cuò)配酶（主要是T7E1酶）將識(shí)別錯(cuò)配的雜合雙鏈并剪 切（參見：化tGenet, 1995, 9:177-183 ;化 1:ure, 2007, 449:621-624!QirrOpinStruct Biol, 2008, 18:86-95)dPCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后跑瓊脂糖凝膠電泳，看是否有切割條帶，若出現(xiàn)切 割條帶，則代表該植株被成功編輯。若沒有出現(xiàn)切割條帶，則代表該植株未被成功編輯。運(yùn) 種方法比克隆測(cè)序的方法快速，花費(fèi)少，但是靈敏度不如克隆測(cè)序法，且有假陽(yáng)性的情況產(chǎn) 生。因此，對(duì)于CRISPR祀向編輯群體中的突變，目前仍缺乏一種準(zhǔn)確率高、成本低廉、快速、 高通量的單株鑒別方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種用于篩選水稻祀向基因編輯植株的方法， 該方法快速、準(zhǔn)確率高、且成本低廉。
[0008] 一種用于篩選水稻祀向基因編輯植株的方法，包括：
[0009] (1)W未經(jīng)編輯的水稻植株為對(duì)照植株，W經(jīng)祀向基因編輯獲得的水稻植株為待 測(cè)植株，分別提取待測(cè)植株的基因組DNA和對(duì)照植株的基因組DNA;
[0010] 似根據(jù)與所述祀向基因編輯的祀位點(diǎn)相鄰的基因組序列來(lái)設(shè)計(jì)特異性引物，W 所提取的基因組DNA為DNA模板，加入所述特異性引物和巧光染料，PCR擴(kuò)增所提取的基因 組DNA中包含編輯位點(diǎn)的DNA片段，所述DNA片段長(zhǎng)度為200~50化P;
[0011] (3)PCR擴(kuò)增完畢后直接進(jìn)行高分辨率烙解曲線化i曲ResolutionMelting,HRM) 分析，W對(duì)照植株所對(duì)應(yīng)的高分辨率烙解曲線為基準(zhǔn)線，比較待測(cè)植株所對(duì)應(yīng)的高分辨率 烙解曲線與對(duì)照植株所對(duì)應(yīng)的高分辨率烙解曲線的最大巧光差異AF，若IAFl<0.05,視 為待測(cè)植株與對(duì)照植株的結(jié)果相同，判定該待測(cè)植株未成功進(jìn)行編輯；若IAFl>0.05， 視為待測(cè)植株與對(duì)照植株的結(jié)果不同，判定該待測(cè)植株編輯成功。
[0012] 本發(fā)明方法中，所述祀向基因編輯是指CRISPR/Cas編輯。
[0013] 本發(fā)明方法中，提取所述水稻植株（包括待測(cè)植株與對(duì)照植株）DNA時(shí)，可W采用 水稻的葉片、根等組織。對(duì)水稻植株（包括待測(cè)植株與對(duì)照植株）DNA的提取方法也沒有特 殊要求，可W為CTAB法、SDS提取法、TPS提取法等，也可W直接采用商用試劑盒，例如：博 日的植物基因組DNA提取試劑盒、天根的植物DNA提取試劑盒等，進(jìn)行DNA的提取。
[0014] 本發(fā)明方法中，所述DNA模板可W為直接提取的單株待測(cè)植株的基因組DNA，也可 W是摩爾比為1:1的待測(cè)植株的基因組DNA和對(duì)照植株的基因組DNA的混合。
[0015] 本發(fā)明方法中，所述DNA片段中GC含量過高時(shí)，采用GCbufferPCR擴(kuò)增。
[0016] 本發(fā)明方法中，所述DNA片段優(yōu)選為200~4(K)bp。
[0017] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述的祀向基因編輯是對(duì)水稻L0C_0s03巧5240基 因的CRISPR祀向編輯，所述水稻L0C_0s03巧5240基因的序列如SEQIDNO: 1所示，其中第 453~471位為編輯位點(diǎn)；此時(shí)，所述特異性引物的序列優(yōu)選如下：
[0018] 上游引物BlF:5, -GCACCGCGTCGGCCTCATGT-3,（SEQIDN0:4)
[0019]下游引物BlR:5'-CCTGCTTAAACTCCTGGGCTTCCAC-3'（SEQIDN0:5) W20] 或者，
[0021] 上游引物B2F:5' -TCACCGAGCACGACGTGACCTT-3'（沈QIDN0:6)
[0022] 下游引物B2R:5, -CACGCTGAGGGAGACCTCGAACA-3'（SEQIDN0:7)
[0023]優(yōu)選所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下srhgiO. 2yL;2XGCbuffer，5yL;2. 5mix dNTP，1.6yL;10yM的上游引物，0.2yL;10yM的下游引物，0.2yL;10XEvaGreen, IJiL;50ng/JiL的DM,IJiL;無(wú)菌水I. 3JiL;礦物油 10-20JiL。
[0024] 優(yōu)選所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min;94°C變性30s，55-65°C退火 30s，72°C延伸30s，共40個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min。
[00巧]在本發(fā)明的另一些實(shí)施方案中，所述的祀向基因編輯是對(duì)水稻大斑基因L0C_ 0sl2gl6720的CRISPR祀向編輯，所述水稻大斑基因L0C_0sl2gl6720的序列如沈QIDN0:8 所示，其中第764~785位為編輯位點(diǎn)；此時(shí)，所述特異性引物的序列如下：
[0026]上游引物T2F:5, -CGGTGGTGATCTCCAAGCC-3'（SEQIDN0:11)
[0027]下游引物T2R:5' -GGGAAGAAGTCGCCGATGGT-3'（SEQIDN0:12)
[0028]優(yōu)選所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下 ^aq, 0. 2yL;2XGCbuffer, 5yL;2. 5mix dNTP，1.6yL;10yM的上游引物，0.2yL;10yM的下游引物，0.2yL;10XEvaGreen， IyL;50ng/yL的DM,IyL;無(wú)菌水I. 3yL;礦物油 10-20yL。
[0029] 優(yōu)選所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min;94°C變性30s，58°C退火30s， 72°C延伸30s，共40個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min。
[0030] 本發(fā)明方法中，對(duì)包含祀向編輯的祀位點(diǎn)的一段核巧酸序列設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增后采用HRM檢測(cè)，由于CRISPR/Cas祀向編輯是針對(duì)特定的位點(diǎn)進(jìn)行突變， CRISPR/Cas祀向編輯成功的植株的DNA只在特定的祀位點(diǎn)上進(jìn)行突變，而正常植株和未成 功編輯的植株則不會(huì)產(chǎn)生DNA的差異，從而實(shí)現(xiàn)基因分型。采用本發(fā)明方法進(jìn)行篩選的結(jié) 果經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，準(zhǔn)確率高，假陽(yáng)性低，表明本發(fā)明的篩選方法有效、結(jié)果準(zhǔn)確。
[0031] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下有益的技術(shù)效果： 陽(yáng)0巧 （1)本發(fā)明的篩選方法中，HRM檢測(cè)不受突變堿基位點(diǎn)與類型局限，無(wú)需序列特異 性探針，在PCR之后可直接用HRM檢測(cè)，即可完成對(duì)樣品突變的分析，省去了瓊脂糖電泳等 步驟，該方法具有操作簡(jiǎn)便快速的優(yōu)點(diǎn)。 陽(yáng)03引 似本發(fā)明的篩選方法中，CRISPR祀向編輯產(chǎn)生的各種突變類型均能與未編輯成 功的植株有效區(qū)分開來(lái)，假陽(yáng)性較低，并且，經(jīng)由測(cè)序驗(yàn)證其準(zhǔn)確率高，該方法有效、結(jié)果準(zhǔn) 確。
[0034] (3)本發(fā)明的篩選方法中，HRM引物易于高通量操作。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可W在儀器上 如Li曲tScanner上直接分型，完成對(duì)突變體植株的鑒定，因此較其他方法更加適用于高通 量分析。
[0035] (4)本發(fā)明的篩選方法中，一次可W同時(shí)檢測(cè)96個(gè)樣品，比克隆測(cè)序和錯(cuò)配酶檢 測(cè)都要節(jié)約成本，該方法具有成本低廉的優(yōu)勢(shì)。
[0036] (5)利用本發(fā)明的方法輔助育種，方便、準(zhǔn)確，節(jié)約成本，能大大提高植株篩選效 率。
【附圖說(shuō)明】
[0037] 圖Ia~Ie分別為實(shí)施例1中雙等位突變的待測(cè)植株樣本、嵌合體的待測(cè)植株樣 本