一種雞快慢羽表型的分子鑒定引物及鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體而言，設(shè)及一種雞快慢羽表型的分子鑒定引物 及鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 雌雄鑒別是現(xiàn)代養(yǎng)雞生產(chǎn)中的重要技術(shù)，由于雞為ZW型性別決定，快慢羽基因位 點位于Z染色體上，慢羽是顯性基因，因而目前很多種雞場通過篩選培育純慢羽系和純快 羽系種群，通過慢羽母雞與快羽公雞雜交的商品代維雞快慢羽自別雌雄，快羽維雞為母雞， 而公雞為慢羽?？炻鸬膮^(qū)分主要是由初生維雞翅膀上的主翼羽和覆主翼羽的長短來確 定。
[0003]快慢羽自別雌雄的鑒定方法最主要的問題是在能進行準確鑒定的時間上有一定 的限制，一般進行羽速鑒定只有在維雞出維后24h內(nèi)才可W進行。此外，要實現(xiàn)羽速自別雌 雄，需要構(gòu)建相應(yīng)的配套系，通過羽速表型構(gòu)建配套系至少需要經(jīng)過2~3個世代才能實 現(xiàn)，并且建系時需從維雞開始。最后，快慢羽的鑒別方法本身也是不夠明確的，當前普遍認 為維雞出生時，主翼羽長于覆主翼羽2mmW上的為快羽，主翼羽比覆主翼羽長2mmW下、等 長或略短的為慢羽，但有時候2mm的差別是不容易辨別的。由于存在W上不足，使快慢羽區(qū) 分性別技術(shù)的推廣與應(yīng)用受到限制，因此很多企業(yè)目前仍采用翻肛等其他傳統(tǒng)方法雌雄鑒 別。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的第一目的在于提供一種雞快慢羽表型的分子鑒定引物，該引物特異性 好，擴增效率高，可用于雞快慢羽表型的分子鑒定。
[0005]本發(fā)明的第二目的在于提供一種雞快慢羽表型的分子鑒定方法，該方法可W解決 快慢羽鑒定中存在的鑒定標準不夠明確、雌雄配套系建系時間長、鑒定時間有限制的問題。
[0006]-種雞快慢羽表型的分子鑒定引物，其堿基序列分別為SEQIDNO: 1和SEQID NO: 2所示。
[0007]通常說來，每增加一個核巧酸引物特異性提高4倍，運樣，大多數(shù)應(yīng)用的最短引物 長度為18個核巧酸。引物長度的上限并不很重要，主要與反應(yīng)效率有關(guān)。
[0008]-般引物長度為18~30堿基，本發(fā)明所述引物長度為18個堿基。由于賭的原因， 較短的引物退火結(jié)合到祀DNA上形成供DNA聚合酶結(jié)合的穩(wěn)定雙鏈模板的速率越大，因而 本發(fā)明所述的引物具有很高的擴增效率。
[0009]一般引物序列中G+C含量一般為40 %~60 %，一對引物的GC含量和Tm值應(yīng)該協(xié) 調(diào)。本發(fā)明所述引物沈QIDN0:1中G+C含量為50%，SEQIDN0:2中G+C含量為55. 6%， 且堿基分布隨機，因而具有適中的解鏈溫度，便于擴增。
[0010] 所述引物自身不存在互補序列（連續(xù)互補堿基小于3bp);引物3'端無修飾不易 錯配；最終擴增產(chǎn)物長度為1305bp，容易成功擴增出目的片段。
[0011] 綜上，該引物特異性好，擴增效率高，可很好的用于雞快慢羽表型的分子鑒定。
[0012] 一種雞快慢羽表型的分子鑒定方法，包括W下步驟：
[0013]1)、模板DNA的提?。簭碾u血凝塊或抗凝雞血中提取總DNA;
[0014]2)、用SEQIDNO: 1和SEQIDN0:2所示引物，W1)所提取的總DNA為模板進行 PCR擴增；
[001引 3)、將2)中PCR擴增得到的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳；
[0016] 4)、對3)中的電泳結(jié)果進行分析。
[0017] 優(yōu)選的，如上所述的雞快慢羽表型的分子鑒定方法，在步驟1)中，所述模板DNA從 雞血凝塊或雞抗凝血中提取。
[0018]用血凝塊法提取DNA模板的優(yōu)點是雞血處理和保存條件較為簡單，不需要額外的 抗凝處理，且可保存較長時間。該方法操作較為簡便，無需特殊設(shè)備，適合一般實驗室開展。
[0019] 抗凝全血在2~8度可保存達兩個月，但隨保存時間的增加，DNA的得率和完整性 會受影響?？鼓腄NA更易抽提，且更穩(wěn)定，DNA含量高。
[0020] 應(yīng)當注意的是，依據(jù)現(xiàn)有技術(shù)或其他可能的技術(shù)從雞血中提取DNA并制備擴增模 板，也可W用于本發(fā)明。
[0021] 優(yōu)選的，所述PCR擴增反應(yīng)體系為：
[0022] SEQ TDNO: 1 0.5^1 SEQ IDNO: 2 0.5叫 2xEsmix 5|a! DNA WM 0部I ddHjO 3Sjil。
[002引其中，上述引物的濃度均為8~12yM;
[0024] 上述從雞血凝塊或抗凝雞血中提取的DNA的濃度一般可達到200~30化g/ul，而 其在PCR擴增體系中的濃度達到2. 5ng/ulW上即可。
[00巧]本發(fā)明設(shè)及同一體系或配比中各組分的量，應(yīng)視為對相關(guān)各組分之間比例關(guān)系的 限定，而不是對各自用量絕對值的限定，各組分之間的比例關(guān)系可適當改變。
[0026] 2XEsmix是2倍濃縮的PCR擴增預(yù)混和溶液，含有化qDNA聚合酶、Mg2\dNTPs 和緩沖液。
[0027]TaqDNA聚合酶具有良好的熱穩(wěn)定性，可在PCR循環(huán)的高溫條件下仍能保持較高 的催化活性；Mg2+是化qDNA聚合酶的輔酶，其濃度直接影響著酶的活性與特異性；dNTPs是 DNA擴增的原料；緩沖液可為化qDNA聚合酶的擴增提供合適的催化條件。
[0028] 優(yōu)選的，如上所述的PCR擴增反應(yīng)體系的相應(yīng)反應(yīng)程序中，退火溫度為60°C，反應(yīng) 循環(huán)次數(shù)為23~35個循環(huán)。
[0029] 通常PCR擴增時的退火溫度為40°C~60°C。退火溫度是由引物的Tm值來決定的， 在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的退火溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高 PCR反應(yīng)的特異性。本發(fā)明所采用的引物退火溫度為6(TC，具有較高的特異性。
[0030] 隨著反應(yīng)的進行，酶會逐漸失活、dNTPs等原料會逐漸消耗掉，此外有一些非特異 產(chǎn)物的擴增也會相應(yīng)增加。因此雖然隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，產(chǎn)物會增多，但循環(huán)次數(shù)依然 不宜過多，因而本發(fā)明限定為23~35個循環(huán)。
[0031] 優(yōu)選的，所述瓊脂糖凝膠電泳所采用的瓊脂糖采用1~1. 2%的瓊脂糖凝膠；電泳 的電壓為130~150V恒壓，電泳時間為20~25分鐘。
[0032] 優(yōu)選的，所述對結(jié)果的判斷方法為，擴增出1305bp目的條帶的模板對應(yīng)的為慢羽 雞；未擴增出該片段的模板對應(yīng)的為快羽雞。
[0033] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0034] 1)、本發(fā)明所用引物特異性好，擴增效率高，且所需模板量較少即可完成PCR反 應(yīng)，可很好的用于雞快慢羽表型的分子鑒定。
[0035]2)、很多分子鑒定實驗都需要兩對或多對引物來擴增出多條擴增產(chǎn)物，有的方法 還需要酶切反應(yīng)來進行輔助鑒定，運些操作無疑增加了鑒定的時間成本和金錢成本；并且 多對引物還容易造成引物之間的交叉污染，不同引物還可能會發(fā)生非特異性結(jié)合；同時不 同引物間的Tm值也可能存在差異，還會對退火溫度的選定造成影響，進而影響擴增效率。 本發(fā)明采用一對引物即可鑒定出雞的羽速類型，避免了W上問題。
[0036]3)、本發(fā)明鑒定準確率可達100%，而傳統(tǒng)的比較主翼羽與覆主翼羽長度的方法準 確率只有90%左右，本發(fā)明有效避免了表型鑒定時存在的人為誤差。
[0037]4)、本發(fā)明解決了對雞進行羽速鑒定只有在維雞出維后24h內(nèi)完成的時間限制。
【附圖說明】
[0038] 圖1為實施3中瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果的掃描圖。
【具體實施方式】
[0039] 下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會 理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可W通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0040] 實施例1
[0041] 一種雞快慢羽表型的分子鑒定方法，包括W下步驟：
[0042] 1)、模板DNA的提?。和ǔ碾u血中提取，當然也可W從其他組織提??；
[0043]2)、用沈QIDNO: 1和沈QIDN0:2所示引物，W1)所提取的DNA為模板進行PCR 擴增；
[0044] 3)、將2)中PCR擴增得到的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳；
[0045] 4)、對3)中的電泳結(jié)果進行分析。
[004引實施例2
[0047] 1、引物制備
[0048] 由生工生物工程（上海）股份有限公司進行引物合成，其中：
[0049]正向引物 1305s:5,CCTCCTTGCCAAACCTTA3,；
[0050]反向引物 1305a:5'ATCAGCCAGATCCGTCAG3'。
[0051] 2、試劑盒提取雞血凝塊DNA步驟：
[0052] 選用康為世紀生物科技有限公司的ClotBloodDNAKit進行提取，產(chǎn)品貨號 CW0545。
[005引（1)稱取凝固血塊0.1~0. 2g，置于離屯、管中，并加入550y1Buffer GTL，電動勻 漿器勻漿，為充分粉碎血塊，可加入小磁珠，進行機械破碎。
[0054] (2)加入20yl蛋白酶K，上下顛倒使樣品充分混勻。在搖床里56°C過夜解育至所 有顆粒完全溶解。
[00巧](3)加入200y1 Buffe巧P，滿旋震蕩20s，冰上解育3~5min。l：M00Xg離屯、3min，將上清移至新的離屯、管中（若上清中還有渾濁，可適當增加離屯、時間）。
[0056] (4)加入1/2體積無水乙醇，滿旋震蕩15s。短暫離屯、，使管壁和蓋子上液體集中 到管底。
[0057] (5)將步驟4中所得溶液全部加入到裝入收集管（CollectionTube)中的吸附柱 (SpinColumnDM)中，若一次不能加完溶液，可分多次轉(zhuǎn)入。13400Xg離屯、Imin,倒掉收集 管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
[005引（6)向吸附柱中加入500y1BufferGWl，13400Xg離屯、Imin,倒掉收集管中的廢 液，將吸附柱重新放回收集管中。
[005引（7)向吸附柱中加入500ulBufferGW2,13400Xg離屯、Imin,倒掉收集管中的廢 液，將吸附柱重新放回收集管中。
[0060]做13400Xg離屯、2min，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘W徹底 驚干。
[006。（9)將吸附柱置于一新離屯、管中，向吸附柱中間部位懸空加入100~200iil BufferGE,室溫放置 2 ~5min，13400Xg離屯、Imin，收集DNA溶液，-20°C保存DM。
[0062] 本方法是經(jīng)多次實驗后優(yōu)選出來的，0. 1~0. 2g的血凝塊較為節(jié)約材料，且提取 DNA的含量較高。
[006引蛋白酶K可W使膜蛋白降解，使與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)降解，從而使DNA充分游離。 通常加入較多的Proteinase時抽提出的DNA含量較高，為了保證消化效果，步驟（2)常采 用過夜解育。
[0064] 加入BufferGE時應(yīng)注意懸空加入，防止移液槍被DNA污染。