阿洛酮糖表異構(gòu)酶突變體和通過使用其制備阿洛酮糖的方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明設及一種阿洛酬糖表異構(gòu)酶突變體；一種重組載體，其包含編碼所述突變 體的基因；W及一種微生物，其包含所述突變體。此外，本發(fā)明設及一種使用所述酶突變體 或所述微生物來制備阿洛酬糖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] D-阿洛酬糖值-psicose)是一種已知為稀有糖（raresugar)的單糖，因為其很少 見于天然材料中或少量存在。阿洛酬糖具有超低能量和類似于糖的甜味，并且因此廣泛用 作功能性甜味劑。
[0003] 阿洛酬糖是果糖（化UCtose)的差向異構(gòu)體，并且具有極類似于果糖的甜度和味 道。不同于果糖，阿洛酬糖幾乎不在體內(nèi)代謝，并且具有幾乎零卡路里。阿洛酬糖可W用 作減肥食品的高效成分，因為阿洛酬糖能夠抑制參與脂質(zhì)合成的酶的活性并且減少腹部肥 胖。此外，廣泛用作糖替代物的如木糖醇等的糖醇當大量食用時可能具有副作用，如造成腹 瀉。相反，阿洛酬糖已知實質(zhì)上不具有副作用。
[0004] 出于運種原因，阿洛酬糖吸引了作為節(jié)食甜味劑的高度關注，并且在食品工業(yè)中 日益需要一種高效生產(chǎn)阿洛酬糖的方法。因此，隨著開發(fā)阿洛酬糖的需要增加，已經(jīng)作出 各種嘗試，W便使用現(xiàn)有生物方法從果糖生產(chǎn)阿洛酬糖。作為能夠?qū)⒐寝D(zhuǎn)化成阿洛酬 糖的酶，已知衍生自根癌上壤桿菌（Agrobacteriumtumefaciens)的阿洛酬糖表異構(gòu)酶 值-psicose3-epimerase，DPE；)和衍生自菊宦假單胞菌（Pseudomonascichorii)或類球 紅細菌煙iodobactersphaeroides)的塔格糖表異構(gòu)酶。已知阿洛酬糖表異構(gòu)酶具有比塔 格糖表異構(gòu)酶更高的活性。 陽0化]在生產(chǎn)阿洛酬糖時，隨著反應溫度升高，生產(chǎn)更多阿洛酬糖。然而，在野生型阿洛 酬糖表異構(gòu)酶用于生產(chǎn)阿洛酬糖的情況下，酶在約50°C或更高的反應溫度下變性，運降低 酶活性，由此造成生產(chǎn)的阿洛酬糖量減少的問題。因此，為了W高效用高效生產(chǎn)阿洛酬糖， 迫切需要一種具有改良的耐熱性的阿洛酬糖表異構(gòu)酶突變體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 技術(shù)問題
[0007] 本發(fā)明人知道了衍生自根癌±壤桿菌的阿洛酬糖表異構(gòu)酶歸因于低熱穩(wěn)定性盡 管有高活性而具有不良效用的問題，因此開發(fā)一種具有改良的熱穩(wěn)定性的阿洛酬糖表異構(gòu) 酶突變體，W及使用運種突變體連續(xù)生產(chǎn)阿洛酬糖的方法，W便當前作為重要食品添加劑 吸引了關注的阿洛酬糖工業(yè)上大規(guī)模地生產(chǎn)。
[0008] 具體來說，本發(fā)明旨在提供一種具有改良的熱穩(wěn)定性的阿洛酬糖表異構(gòu)酶突變 體，其通過取代野生型阿洛酬糖表異構(gòu)酶的氨基酸序列的特定位置處的氨基酸進行。
[0009] 另外，本發(fā)明旨在提供一種多核巧酸，其編碼具有改良的熱穩(wěn)定性的阿洛酬糖表 異構(gòu)酶突變體。
[0010] 此外，本發(fā)明旨在提供一種重組載體，其包含編碼阿洛酬糖表異構(gòu)酶突變體的基 因。
[0011] 此外，本發(fā)明旨在提供一種重組微生物，其經(jīng)轉(zhuǎn)型W生產(chǎn)阿洛酬糖表異構(gòu)酶突變 體。
[0012] 此外，本發(fā)明旨在提供一種使用阿洛酬糖表異構(gòu)酶突變體或經(jīng)轉(zhuǎn)型W生產(chǎn)阿洛酬 糖表異構(gòu)酶突變體的重組微生物來從果糖制備阿洛酬糖的方法。
[0013] 技術(shù)解決方案
[0014] 本發(fā)明提供一種具有改良的熱穩(wěn)定性的阿洛酬糖表異構(gòu)酶突變體，W高效生產(chǎn)阿 洛酬糖，其通過取代野生型阿洛酬糖表異構(gòu)酶的氨基酸序列的特定位置處的氨基酸進行。
[0015] 具體來說，本發(fā)明提供一種阿洛酬糖表異構(gòu)酶突變體，其包含如下氨基酸序列，其 中衍生自根癌±壤桿菌（Agrobacteriumtume化ciens)的野生型阿洛酬糖表異構(gòu)酶的氨基 酸序列的位置77處的谷氨酸經(jīng)脯氨酸取代。
[0016] 所述突變體可W包含如下氨基酸序列，其中野生型阿洛酬糖表異構(gòu)酶的氨基酸序 列的位置33處的異亮氨酸進一步經(jīng)由W下所構(gòu)成的族群中選出的氨基酸取代：亮氨酸、半 脫氨酸W及鄉(xiāng)氨酸，和/或野生型阿洛酬糖表異構(gòu)酶的氨基酸序列的位置213處的絲氨酸 進一步經(jīng)半脫氨酸取代。
[0017] 所述突變體可W包含如下氨基酸序列，其中野生型阿洛酬糖表異構(gòu)酶的氨基酸序 列的位置33處的異亮氨酸進一步經(jīng)亮氨酸取代，并且野生型阿洛酬糖表異構(gòu)酶的氨基酸 序列的位置213處的絲氨酸進一步經(jīng)半脫氨酸取代。
[0018] 本發(fā)明還設及一種多核巧酸，其編碼根據(jù)本發(fā)明的阿洛酬糖表異構(gòu)酶突變體。
[0019] 本發(fā)明還設及一種重組載體，其包含編碼根據(jù)本發(fā)明的阿洛酬糖表異構(gòu)酶突變體 的基因。
[0020] 本發(fā)明設及一種重組微生物，其經(jīng)轉(zhuǎn)型W生產(chǎn)所述阿洛酬糖表異構(gòu)酶突變體。
[0021] 本發(fā)明還設及一種生產(chǎn)阿洛酬糖的方法，其包含：提供給果糖W本發(fā)明的阿洛酬 糖表異構(gòu)酶突變體或經(jīng)轉(zhuǎn)型W生產(chǎn)所述阿洛酬糖表異構(gòu)酶突變體的重組微生物，由此引起 酶反應訊
[0022] 提純所得酶反應物質(zhì)W獲得阿洛酬糖。
[0023] 本發(fā)明還設及一種用于生產(chǎn)阿洛酬糖的固定反應器，其包含填充有載體的管柱， 根據(jù)本發(fā)明的阿洛酬糖表異構(gòu)酶突變體或經(jīng)轉(zhuǎn)型W生產(chǎn)所述突變體的重組微生物固定到 所述載體。
[0024] 本發(fā)明進一步設及一種生產(chǎn)阿洛酬糖的方法，其通過將果糖溶液引入到所述固定 反應器中來進行。 陽0對有利效果
[00%] 本發(fā)明提供一種具有顯著改良的熱穩(wěn)定性同時維持酶活性的阿洛酬糖表異構(gòu)酶 突變體，其中野生型阿洛酬糖表異構(gòu)酶的氨基酸序列的特定位置處的氨基酸經(jīng)取代，由此 允許當前作為食品原料吸引了關注的阿洛酬糖更高效地并且工業(yè)上大規(guī)模地生產(chǎn)。
[0027] 具體來說，與野生型阿洛酬糖表異構(gòu)酶或其目前已知的突變體相比，根據(jù)本發(fā)明 的一個實施例的阿洛酬糖表異構(gòu)酶突變體在酶反應溫度下具有顯著延長的半衰期，由此允 許所制備的阿洛酬糖表異構(gòu)酶長時間用于生產(chǎn)阿洛酬糖。因此，根據(jù)本發(fā)明的阿洛酬糖表 異構(gòu)酶突變體可W減少生產(chǎn)時間和成本，由此改良生產(chǎn)效率。
[002引此外，根據(jù)本發(fā)明的另一個實施例，阿洛酬糖可W使用包含編碼所述阿洛酬糖表 異構(gòu)酶突變體的基因的重組載體或經(jīng)轉(zhuǎn)型W生產(chǎn)所述阿洛酬糖表異構(gòu)酶突變體的重組微 生物來大規(guī)模地高效生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0029] 圖1描繪衍生自根癌±壤桿菌的野生型阿洛酬糖表異構(gòu)酶的分子模型。
[0030] 圖2是描繪實例1的阿洛酬糖表異構(gòu)酶突變體與比較例1的野生型阿洛酬糖表異 構(gòu)酶相比的熱穩(wěn)定性的圖。
[0031] 圖3是描繪實例2的阿洛酬糖表異構(gòu)酶突變體（133L/E77P/S213C)與比較例2的 常規(guī)阿洛酬糖表異構(gòu)酶突變體（133L/S213C)相比的熱穩(wěn)定性的圖。
【具體實施方式】
[0032] 在下文中，將對本發(fā)明進行更詳細描述。本文中將省略對為在此技術(shù)領域或相關 領域中具有通常知識的本領域技術(shù)人員所顯而易知的細節(jié)的描述。
[0033] 本發(fā)明設及一種阿洛酬糖表異構(gòu)酶突變體（下文稱為E77P突變體），其包含如下 氨基酸序列，其中衍生自根癌上壤桿菌（Agrobacteriumtumefaciens)的野生型阿洛酬糖 表異構(gòu)酶的氨基酸序列的位置77處的谷氨酸經(jīng)脯氨酸取代。酶突變體的氨基酸序列闡述 于沈QIDNO:2中。
[0034] 根癌±壤桿菌是一種已知菌株，并且更詳細地說，可W使用根癌±壤桿菌ATCC 33970。
[0035] 衍生自根癌±壤桿菌的野生型阿洛酬糖表異構(gòu)酶的構(gòu)形在2006年發(fā)現(xiàn)，并且目 前其構(gòu)形信息公開于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（ProteinDataBank,下文稱為"PDB")中。阿洛酬 糖表異構(gòu)酶（PDBID:2HK1)由309個氨基酸組成，并且已知可形成復合物，即由四個單體 (monomer)組成的四聚體（tetramer)。野生型阿洛酬糖表異構(gòu)酶具有如下結(jié)構(gòu)，其中a-螺 旋（a-helix)和0-鏈（0-strand)反復連接W形成活性位點（activesite),作為底物 的果糖能夠結(jié)合到所述活性位點。
[0036] 衍生自根癌±壤桿菌的野生型阿洛酬糖表異構(gòu)酶包含闡述于SEQIDNO: 1中的氨 基酸序列或其功能片段。如本文所用，術(shù)語"功能片段"可W指包含歸因于SEQIDNO:1的 氨基酸序列中的一些氨基酸的取代、插入或缺失的突變并且具有將果糖轉(zhuǎn)化成阿洛酬糖的 活性的片段。
[0037] E77P突變體可W包含如下氨基酸序列，其中野生型阿洛酬糖表異構(gòu)酶的氨基酸序 列的位置33處的異亮氨酸進一步經(jīng)由W下所構(gòu)成的族群中選出的氨基酸取代：亮氨酸、半 脫氨酸W及鄉(xiāng)氨酸，和/或野生型阿洛酬糖表異構(gòu)酶的氨基酸序列的位置213處的絲氨酸 進一步經(jīng)半脫氨酸取代。 陽