通用擴增W相對于聚（A)mRNA尾部引發(fā)。
[0071] 圖10說明用祀端特異性探針標(biāo)記和擴增祀標(biāo)的示例性示意圖。探針與祀物質(zhì)的 末端序列互補，因此將其比對W便兩個末端上銜接子的連接。 陽〇巧圖11說明用于檢測核酸祀內(nèi)部序列的核酸酶消化的示例性示意圖。雜交后，祀標(biāo) 的單鏈區(qū)域被核酸酶消化。接著標(biāo)記并且擴增截短祀標(biāo)W便檢測或分離。 柳7引 定義
[0074] 為了使本發(fā)明更易于理解，在下文對某些術(shù)語進行定義。W下術(shù)語和其它術(shù)語的 其它定義闡述在整個說明書中。
[0075] "鄰近"：如本文所使用，術(shù)語"鄰近"意指"緊鄰V哺連"、"郵連"、"鄰接"或具有 共同邊界。
[0076] "分析物"：如本文所使用，術(shù)語"分析物"廣泛地指任何有待分析、檢測、測量或定 量的物質(zhì)。分析物的實例包括（但不限于）蛋白質(zhì)、膚、激素、半抗原、抗原、抗體、受體、酶、 核酸W及其組合。
[0077] "結(jié)合"：如本文所使用，術(shù)語"結(jié)合"、"綴合V嘴接"、"附接"、"絡(luò)合"W及"系留" W及語法等效物通常是指兩個或更多個部分彼此直接或間接（例如經(jīng)由一或多個充當(dāng)連 接劑的額外部分）相連W形成足夠穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，從而使得所述部分在結(jié)構(gòu)所使用的條件， 例如生理條件下保持相連。在一些實施例中，部分通過一或多個共價鍵彼此附接。在一些 實施例中，所述部分通過設(shè)及特異性（但非共價）結(jié)合的機制（例如抗生蛋白鏈菌素/抗 生物素蛋白相互作用、抗體/抗原相互作用等）彼此附接?；蛘呋蛄硗猓銐驍?shù)目的較弱相 互作用（非共價）可W為部分提供足夠的穩(wěn)定性W保持相連。示例性非共價相互作用包括 (但不限于）親和力相互作用、金屬配位、物理吸附、主-賓相互作用、疏水性相互作用、n 堆疊相互作用、氨鍵合相互作用、凡得瓦爾力（vanderWaals)相互作用、磁相互作用、靜電 相互作用、偶極-偶極相互作用等。
[0078] "補體"：如本文所使用，術(shù)語"補體"、"互補"W及"互補性"是指根據(jù)沃森/克里 克（Watson/化ick)配對規(guī)則，核巧酸序列的配對。舉例來說，序列5'-GCGGTCCCA-3'的互 補序列是5'-TGGGACCGC-3'。補體序列還可W是與DNA序列互補的RNA序列。某些在天然 核酸中不常見的堿基可W包括于互補核酸中，所述核酸包括（但不限于）肌巧、7-脫氮鳥嚷 嶺、鎖核酸（LNA)W及膚核酸（PM)?；パa不必是完美的；穩(wěn)定雙螺旋體可W含有錯配的堿 基對、變性或不匹配的堿基。核酸技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可W憑經(jīng)驗考慮包括例如寡核巧酸 長度、堿基組成和寡核巧酸序列、離子強度W及錯配的堿基對的發(fā)生率的多種變量來測定 雙螺旋體穩(wěn)定性。
[0079] "同時"和"非同時"：如本文所使用，術(shù)語"同時"、"同時地"或語法等效物意指多 個事件在相同時間進行或發(fā)生而無可檢測或可鑒別的順序次序。如本文所使用，術(shù)語"非同 時"、"非同時地"或語法等效物意指多個事件W可檢測或可鑒別的順序次序進行或發(fā)生。
[0080] "粗":如本文所使用，術(shù)語"粗"在與生物樣品結(jié)合使用時是指樣品處于實質(zhì)上未 精煉的狀態(tài)。舉例來說，粗樣品可W是細胞裂解物或活檢體組織樣品。粗樣品可W溶液形 式或干燥制劑形式存在。 陽〇81]"編碼區(qū)域巧ncodingregion)"、"編碼區(qū)域（codingregion)"或"帶條碼區(qū)域"： 如本文所使用，術(shù)語"編碼區(qū)域（encodingregion)"、"編碼區(qū)域（codingregion)"、"帶條 碼區(qū)域"或語法等效物是指可W用于鑒別物件或襯底（例如粒子）的物件或襯底（例如粒 子）上的區(qū)域。運些術(shù)語可W互換使用。通常，物件的編碼區(qū)域攜有與物件的特性相關(guān)的圖 形和/或光學(xué)特征。此類圖形和/或光學(xué)特征也稱為物件的標(biāo)簽特征。在一些實施例中， 物件的編碼區(qū)域攜有導(dǎo)致可變的巧光強度（一或多個波長）的空間圖案化特征（例如具有 各種形狀和/或尺寸的條帶或一連串具有各種尺寸的孔桐）。在一些實施例中，物件的編碼 區(qū)域攜有導(dǎo)致各種圖案中可變的巧光信號（例如不同顏色和/或強度）的各種空間圖案中 的各種類型和/或量的巧光團或其它可檢測部分。
[0082] "官能化":如本文所使用，術(shù)語"官能化"是指通過引入不同于材料上最初發(fā)現(xiàn)的 特征的物理、化學(xué)或生物特征來修飾材料的任何工藝。通常，官能化設(shè)及將官能團引入材料 中。如本文所使用，官能團是分子內(nèi)負責(zé)那些分子的特有化學(xué)反應(yīng)的原子的特定基團。如 本文所使用，官能團包括兩個化學(xué)基團（例如醋、簇酸醋、烷基）和生物基團（例如寡核巧 酸銜接子或連接體序列）。
[0083] "雜交"：如本文所使用，術(shù)語"雜交化ybridize)"或"雜交化ybridization)"是 指一種工藝，其中兩個互補核酸鏈在適當(dāng)嚴(yán)格條件下彼此退火。適用于雜交的寡核巧酸或 探針通常含有10-100個核巧酸的長度（例如18-50、12-70、10-30、10-24、18-36個核巧酸 的長度）。核酸雜交技術(shù)在所屬領(lǐng)域中是眾所周知的。參見例如薩布魯克（Sambrook)等 人，1989,分子克隆實驗指南（Mole州IarCloning=AL油oratoryManual),第二版，冷泉 港出版社（ColdSpringHarborPress),普萊恩維尤（Plainview),紐約（N.Y.)。所屬領(lǐng) 域的技術(shù)人員理解如何評估并且調(diào)整雜交條件的嚴(yán)格度W使得具有至少所希望水平的互 補的序列將穩(wěn)定雜交，而具有較低互補水平的那些將不會如此。關(guān)于雜交條件和參數(shù)的實 例，參見例如薩布魯克等人，1989,分子克隆實驗指南，第二版，冷泉港出版社，普萊恩 維尤，紐約；奧斯貝（Ausubel),F.M.等人1994,最新分子生物學(xué)實驗方法匯編（化rrent ProtocolsinMolecularBiology).約翰?威利父子公司（JohnWiley&Sons),斯考克斯 (Secaucus),新澤西州（N.J.)。
[0084]"惰性區(qū)域":如本文所使用，術(shù)語"惰性區(qū)域"、呵營性間隔基"或語法等效物在與襯 底（例如粒子）上的區(qū)域結(jié)合使用時是指高于預(yù)定觸發(fā)闊值、流通掃描裝置（如流式細胞 儀）不可檢測的區(qū)域。通常，惰性區(qū)域或間隔基是非官能化區(qū)域。舉例來說，惰性區(qū)域是未 裝載有探針或其它可檢測部分的區(qū)域。
[00化]"詢問（Interrogate)":如本文所使用，術(shù)語"詢問（interrogate)"、"詢問 (interrogating)"、"詢問（interrogation)"或語法等效物是指表征或檢查W獲得數(shù)據(jù)的 過程。
[OOM]"標(biāo)記"：術(shù)語"標(biāo)記"和"標(biāo)記有可檢測試劑或部分"在本文中可互換使用W指定 實體（例如核酸探針、抗體等）在例如結(jié)合到另一個實體（例如核酸、多膚等）之后可W被 觀測到?？蒞選擇可檢測試劑或部分W使得其產(chǎn)生可W被測量并且其強度與所結(jié)合實體 的量相關(guān)（例如成正比）的信號。用于標(biāo)記和/或檢測蛋白質(zhì)和膚的廣泛多種系統(tǒng)是所 屬領(lǐng)域中已知的。標(biāo)記的蛋白質(zhì)和膚可W通過并入或綴合通過光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免 疫化學(xué)、電氣、光學(xué)、化學(xué)或其它手段可檢測到的標(biāo)記來制備。標(biāo)記或標(biāo)記部分可W是直接 可檢測的（即，其不需要任何進一步反應(yīng)或操作而為可檢測的，例如，巧光團是直接可檢測 的）或其可W是間接可檢測的（即，通過與另一種可檢測的實體反應(yīng)或結(jié)合來使其為可檢 測的，例如半抗原通過在與包含如巧光團的報告子的適當(dāng)抗體反應(yīng)之后的免疫染色而是可 檢測的）。適合的可檢測試劑包括（但不限于）放射性核巧酸、巧光團、化學(xué)發(fā)光劑、微米粒 子、酶、比色標(biāo)記、磁性標(biāo)記、半抗原、分子信標(biāo)、適體信標(biāo)等。
[0087] "單分散":如本文所使用，術(shù)語"單分散"或"單尺寸"是指當(dāng)在粒子的情況下時具 有實質(zhì)上相同尺寸和形狀并且在聚合物的情況下具有實質(zhì)上相同質(zhì)量的物件的集合。相反 地，具有不一致的尺寸、形狀和質(zhì)量分布的物件的集合稱為多分散的。通常通過使用基于模 板的合成來合成單分散粒子。
[0088] "物件"或"襯底":如本文所使用，術(shù)語"物件"和"襯底"可互換使用并且是指任何 離散質(zhì)量體。物件或襯底可W是粒子、珠粒、平面表面、隧菌體、大分子、細胞、微生物等。
[0089] "粒子":如本文所使用，術(shù)語"粒子"是指離散物件。此類物件可W具有任何形狀或 尺寸。粒子組成可W變化，取決于應(yīng)用和合成方法。適合的材料包括（但不限于）塑料、陶 瓷、玻璃、聚苯乙締、甲基苯乙締、丙締酸聚合物、金屬、順磁材料、氧化社溶膠、石墨化碳、二 氧化鐵、乳膠或交聯(lián)葡聚糖（如瓊脂糖）、纖維素、尼龍、交聯(lián)微膠粒W及特富龍（teflon)。 在一些實施例中，粒子可W是W光學(xué)方式或W磁性方式可檢測的。在一些實施例中，粒子含 有巧光或發(fā)光部分或其它可檢測部分。在一些實施例中，直徑小于1000微米（ym)的粒子 也稱為微米粒子。在一些實施例中，直徑小于1000納米（nm)的粒子也稱為納米粒子。
[0090] "聚核巧酸（Polynucleotide)"、"核酸（nucleicacid)"或"寡核巧酸 (oligonucleotide)":術(shù)語"聚核巧酸"、"核酸"或"寡核巧酸"是指核巧酸的聚合物。術(shù)語 "聚核巧酸"、"核酸"W及"寡核巧酸"可互換使用。通常，聚核巧酸包含至少=個核巧酸。 DNA和RNA是聚核巧酸。聚合物可W包括天然核巧（即，腺巧、胸巧、鳥巧、胞巧、尿巧、脫氧 腺巧、脫氧胸巧、脫氧鳥巧W及脫氧胞巧）、核巧類似物（例如2-氨基腺巧、2-硫代胸巧、肌 巧、化咯并-喀晚、3-甲基腺巧、C5-丙烘基胞巧、C5-丙烘基尿巧、C5-漠尿巧、C5-氣尿巧、 C5-艦?zāi)蚯伞⑶?甲基胞巧、7-脫氮腺巧、7-脫氮鳥巧、8-氧代腺巧、8-氧代鳥巧、0(6)-甲 基鳥嚷嶺W及2-硫代胞巧）、經(jīng)化學(xué)修飾的堿基、經(jīng)生物修飾的堿基（例如甲基化堿基）、 插入堿基、經(jīng)修飾的糖（例如2'-氣核糖、核糖、2'-脫氧核糖、阿拉伯糖W及己糖）或經(jīng) 修飾的憐酸醋基（例如硫代憐酸醋和5' -N-亞憐酷胺鍵）。
[0091] "探針"：如本文所使用，術(shù)語"探針"是指具有可變長度（例如3-1000個堿基長） 的DNA或RNA片段，其用于檢測與探針中的序列互補的祀核巧酸序列的存在。通常，探針與 單鏈核酸值NA或RNA)雜交，所述核酸的堿基序列由于探針與祀標(biāo)之間的互補性而允許探 針-祀標(biāo)堿基配對。
[0092] "二級結(jié)構(gòu)"：如本文所使用，術(shù)語"二級結(jié)構(gòu)"在與核酸結(jié)構(gòu)結(jié)合使用時是指由單 一分子或相互作用分子組內(nèi)的堿基配對相互作用形成的任何結(jié)構(gòu)。示例性二級結(jié)構(gòu)包括 莖-環(huán)或雙螺旋。
[0093] "信號":如本文所使用，術(shù)語"信號"是指可檢測和/或可測量的實體。在某些實 施例中，信號可由人類眼睛檢測到，例如是可見的。舉例來說，信號可W是或可W設(shè)及可見 光譜中的顏色的強度和/或波長。此類信號的非限制性實例包括由例如酶反應(yīng)的化學(xué)反應(yīng) 產(chǎn)生的有色沉淀物和有色可溶性產(chǎn)物。在某些實施例中，信號可使用設(shè)備檢測到。在一些 實施例中，信號由在激發(fā)時發(fā)出巧光的巧光團產(chǎn)生，其中光是可使用巧光檢測器檢測的。在 一些實施例中，信號是或設(shè)及通過分光光度計可檢測的光（例如可見光和/或紫外光）。舉 例來說，由化學(xué)發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生的光可W用作信號。在一些實施例中，信號是或設(shè)及福射，例 如放射性同位素發(fā)出的福射、紅外福射等。在某些實施例中，信號是物理實體的特性的直接 或間接指示物。舉例來說，信號可W用作生物樣品和/或反應(yīng)容器中的核酸的量和/或濃 度的指示物。
[0094] "特異性":如本文所使用，術(shù)語"特異性"在與寡核巧酸引物結(jié)合使用時是指在適 當(dāng)?shù)碾s交或洗涂條件下寡核巧酸或引物能夠與相關(guān)祀標(biāo)雜交并且實質(zhì)上不與不相關(guān)核酸 雜交。較高水平的序列一致性是優(yōu)選的并且包括至少60 %、65 %、70 %、75 %、80 %、85 %、 90 %、95 %、98 %、99 %或100 %的序列一致性。在一些實施例中，當(dāng)比對寡核巧酸和核酸時， 特異性寡核巧酸或引物與待雜交或擴增核酸的一部分含有至少4、6、8、10、12、14、16、18、 20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70 或更多個堿基的序列一致性。
[0095] "莖-環(huán)":如本文所使用，術(shù)語"莖-環(huán)"在與核酸結(jié)構(gòu)結(jié)合使用時是指由通常發(fā) 生在單鏈DNA或RNA中的分子內(nèi)堿基配對產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)。所述結(jié)構(gòu)也稱為發(fā)夾或發(fā)夾環(huán)。通 常，其在相同鏈的兩個區(qū)域（當(dāng)沿相反方向讀取時核巧酸序列通常互補）堿基配對形成雙 螺旋時發(fā)生，所述雙螺旋W未配對環(huán)結(jié)束，產(chǎn)生棒棒糖狀結(jié)構(gòu)。
[0096] "實質(zhì)上":如本文所使用，術(shù)語"實質(zhì)上"是指展現(xiàn)完全或近乎完全范圍或程度的 相關(guān)特征或特性的定性條件。生物學(xué)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解，生物學(xué)和化學(xué)現(xiàn)象很少 (如果發(fā)生過）達到完全和/或進行到完全或者實現(xiàn)或避免絕對結(jié)果。因此，術(shù)語"實質(zhì)上" 在本文中用于捕獲許多生物學(xué)和化學(xué)現(xiàn)象中所固有的潛在完全性缺乏。
[0097] "實質(zhì)上互補"：如本文所使用，術(shù)語"實質(zhì)上互補"是指在嚴(yán)格的雜交條件下可W 雜交的兩個序列。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，實質(zhì)上互補的序列無需沿著其整個長度雜 交。在一些實施例中，"嚴(yán)格的雜交條件"是指至少與W下一樣嚴(yán)格的雜交條件：在42°C下 于 50% 甲酯胺，5XSSC，50mM化H2P〇4(pH6. 8)，0. 5%SDS，0.Img/血超聲處理娃魚精子DNA W及5X登哈特值enhart's)溶液中雜交過夜；在45°C下用2XSSC、0. 1%SDS洗涂；并且 在45°C下用0. 2XSSC、0. 1%SDS洗涂。在一些實施例中，嚴(yán)格的雜交條件應(yīng)不允許在20 個連續(xù)核巧酸的延伸物上有兩個W上堿基不同的兩個核酸雜交。 【具體實施方式】
[0098] 本發(fā)明尤其提供用于祀核酸的多重分析（例如同時單一或多個祀標(biāo)）的方法和組 合物。如本文所使用，多重分析包括（但不限于）同時捕獲、擴增、檢測、分析和/或定量單 一祀核酸或多個祀核酸。
[0099] 本發(fā)明的各個方面詳細地描述于W下章節(jié)中。章節(jié)的使用并不意味著限制本發(fā) 明。各個章節(jié)可W適用于本發(fā)明的任何方面。在本申請中，除非另外說明，否則使用"或"意 指"和/或"。
[0100] 祀核酸 陽101] 本文所描述的方法和組合物可W用于分析任何祀核酸。一般來說，祀核酸可W是 樣品中所存在的任何形式的DNA、RNA、DNA/RNA嵌合體或其任何組合。 陽102] 樣品 陽103] 包括（但不限于）生物樣品和化學(xué)或重組制劑的多種樣品中的任一者可W適合與 本文所公開的方法一起使用。一般來說，可W使用含有核酸的任何生物樣品（例如細胞、組 織等）。生物樣品的類型包括（但不限于）細胞、細胞裂解物、FFPE(FASP蛋白質(zhì)消化）消 化物、組織（包括組織活檢體）、全血、血漿、血清、尿液、大便、唾液、廝帶血、絨毛膜絨毛樣 品、羊水W及經(jīng)子宮頸灌洗液。上文所提及的生物樣品中的任一者的細胞培養(yǎng)物也可W根 據(jù)本發(fā)明方法使用，例如絨毛培養(yǎng)物、羊水和/或羊水細胞培養(yǎng)物、血細胞培養(yǎng)物（例如淋 己細胞培養(yǎng)物）等。在一些實施例中，生物樣品包含患病細胞，如癌癥或腫瘤細胞。在一些 實施例中，生物樣品是產(chǎn)前樣品。 陽104] 因此，適用于本發(fā)明的典型生物樣品含有異質(zhì)核酸。在一些實施例中，生物樣品含 有來自不同細胞類型（例如正常細胞和患病細胞，如腫瘤細胞）的核酸的混合物。在一些 實施例中，生物樣品（例如血液、血清或血漿）含有母體核酸與胎兒核酸的混合物。適合的 樣品可W是未純化或最低限度純化的生物樣品或可W由分離的核酸DNA或RNA、尿液或血 漿/血清制得。
[0105] 在一些實施例中，本發(fā)明用于分析在生物樣品中作為罕見事件存在的祀核酸（也 稱為低豐度核酸）。在一些實施例中，本發(fā)明的創(chuàng)造性方法所檢測到的祀核酸的量占生物樣 品中的總核酸的小于1% (例如小于0. 5%、0. 1%、0. 01%、0. 001%、0. 0001% )。在一些實 施例中，本發(fā)明的創(chuàng)造性方法所檢測到的祀核酸的量占生物樣品中的總核酸的小于百萬分 之一。在一些實施例中，本發(fā)明的創(chuàng)造性方法所檢測到的祀核酸的量占生物樣品中的總核 酸的小于千萬分之一。在一些實施例中，本發(fā)明用于分析少至核酸祀標(biāo)的一個單一拷貝或 多達核酸祀標(biāo)的一百萬或更多個拷貝。
[0106] 在一些實施例中，適合的樣品可W是含有活體外或重組合成核酸（如siRNA、 mRNA、微RNA、適體、DM、質(zhì)粒、載體等）的化學(xué)制劑或反應(yīng)混合物。 陽107] 不同祀標(biāo)
[0108] 在各種實施例中，祀核酸可W是包括例如微生物或感染物或其任何天然存在的、 經(jīng)生物工程改造的或合成的組分的生物生物體中發(fā)現(xiàn)的祀核酸。在本發(fā)明的某些實施例 中，祀核酸可W是或含有基因、調(diào)節(jié)序列、基因組DNA、cDNA、RNA(包括mRNA、rRNA、微RNA、小 干擾RNA(SiRNA)、較長非編碼RNAQncRNA)、小核RNA(snRNA)、雙鏈RNA(dsRNA))或其任 何組合的一部分。在本發(fā)明的某些實施例中，祀核酸可W是核酸類似物或人工核酸，如DNA/ RNA嵌合體。
[0109] 在一些實施例中，本文中所提供的方法用于檢測和/或定量miRNA。miRNA可W在 人類、動物、植物和病毒的基因組中發(fā)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明，在一些實施例中，祀核酸可W是或包 含一或多個由內(nèi)源發(fā)夾狀轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生的miRNA。在一些實施例中，祀核酸可W是或包含一或 多個例如通過動物中的RNA聚合酶II酶轉(zhuǎn)錄為較長初級轉(zhuǎn)錄物（pri-微RNA)的miRNA。 目前miRNA數(shù)據(jù)庫（可通過萬維網(wǎng)在microrna.sanger.ac.uk/sequences/f1:p獲得）中總 共列出1424種人類miRNA基因，其相當(dāng)于幾乎3%的蛋白質(zhì)編碼基因。許多miRNA被認(rèn)為 在調(diào)芐基因表達方面是重要的。通常，微RNAW前體形式產(chǎn)生并且接著通常通過裂解前體 莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的3'支路處理成成熟形式。因此，前體微RNA和成熟微RNA具有相同的5'端 但不同的3'端。通過設(shè)計與3'端序列互補的捕獲序列，選擇性末端標(biāo)記可W用于檢測成 熟微RNA物質(zhì)而不檢測前體物質(zhì)。
[0110] 捕獲樣品中的祀核酸 陽111] 根據(jù)本發(fā)明，祀核酸可W首先通過使樣品與一或多個捕獲探針接觸來捕獲。如本 文所使用，術(shù)語"捕獲探針"是指包含至少一個祀捕獲序列的探針。如本文所使用，術(shù)語"祀 捕獲序列"是指能夠結(jié)合到祀核酸（例如微RNA)的核酸序列。在一些實施例中，捕獲探針 包含單一祀捕獲序列并且特異性結(jié)合到一種不同祀核酸。在一些實施例中，捕獲探針包含 多個（例如2、3、4、5、10或更多個）不同祀捕獲序列并且結(jié)合到多個（例如2、3、4、5、10或 更多個）不同祀核酸。示例性適合的祀捕獲序列描述如下。
[0112] 在一些實施例中，適用于本發(fā)明的捕獲探針進一步包括一或多個銜接子結(jié)合序列 W便結(jié)合經(jīng)特別設(shè)計W例如充當(dāng)聚合酶鏈反應(yīng)引發(fā)、逆轉(zhuǎn)錄或通過其它DNA修飾或RNA修 飾酶的修飾的位點的銜接子。示例性適合的銜接子描述如下。
[0113] 根據(jù)本發(fā)明，一或多個祀捕獲序列和一或多個銜接子結(jié)合序列經(jīng)配置W使得一或 多個祀核酸和一或多個銜接子與捕獲探針的結(jié)合準(zhǔn)許一或多個銜接子連接到一或多個祀 核酸。舉例來說，捕獲探針可W包括在5'端、3'端或兩處鄰近銜接子結(jié)合序列的祀捕獲序 列。在一些實施例中，捕獲探針可W包括多個祀捕獲序列，其中各祀捕獲序列通過一或多個 鄰近銜接子結(jié)合序列成帖。在一些實施例中，鄰近意指在祀核酸和銜接子都結(jié)合到捕獲探 針后，祀標(biāo)的3'端將鄰接銜接子的5'端，或替代地，在祀核酸和銜接子都結(jié)合到捕獲探針 后，祀標(biāo)的5'端將鄰接銜接子的3'端。
[0114] 適合的探針通常具有足夠大的長度W尤其與其祀標(biāo)雜交但未大到阻礙雜交過程。 尺寸可W取決于祀標(biāo)-探針絡(luò)合物的所需烙融溫度或祀標(biāo)鑒別所需的特異度。在一些實 施例中，適合的探針含有約10-200個核巧酸（例如10-150、10-100、10-90、10-80、10-70、 10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、20-200、20-150、20-100、20-90、20-80、20-70、20-60、 20-50、30-200、30-150、30-100、30-90、30-80、30-70、30-60 或 30-50 個核巧酸）。所屬領(lǐng)域 中可用的各種方法和軟件可W用于設(shè)計特異性探針。
[0115] 根據(jù)本發(fā)明的探針可W包括天然核巧（即，腺巧、胸巧、鳥巧、胞巧、尿巧、脫氧腺 巧、脫氧胸巧、脫氧鳥巧W及脫氧胞巧）、核巧類似物（例如2-氨基腺巧、2-硫代胸巧、肌 巧、化咯并-喀晚、3-甲基腺巧、C5-丙烘基胞巧、C5-丙烘基尿巧、C5-漠尿巧、C5-氣尿巧、 C5-艦?zāi)蚯伞⑶?甲基胞巧、7-脫氮腺巧、7-脫氮鳥巧、8-氧代腺巧、8-氧代鳥巧、0(6)-甲 基鳥嚷嶺W及2-硫代胞巧）、經(jīng)化學(xué)修飾的堿基、經(jīng)生物修飾的堿基（例如甲基化堿基）、 插入堿基、經(jīng)修飾的糖（例如2'-氣核糖、核糖、2'-脫氧核糖、阿拉伯糖W及己糖）或經(jīng) 修飾的憐酸醋基（例如硫代憐酸醋和5' -N-亞憐酷胺鍵）。
[0116] 祀捕獲序列
[0117] 在一些實施例中，適合的祀捕獲序列對祀核酸（例如DNA、mRNA或微RNA)具有特 異性。術(shù)語"特異性"在與雜交探針結(jié)合使用時是指可W在嚴(yán)格條件下結(jié)合到其祀標(biāo)但不 會結(jié)合到其它區(qū)域的序列。在一些實施例中，"嚴(yán)格的雜交條件"是指至少與W下一樣嚴(yán)格 的雜交條件：在 42°C下于 50% 甲酯胺，5XSSC，50mMNaH2P〇4(pH6. 8)，0. 5%SDS，0.Img/mL 超聲處理娃魚精子DNAW及5X登哈特溶液中雜交過夜；在45°C下用2XSSC、0. 1%SDS洗 涂；并且在45°C下用0. 2XSSC、0. 1%SDS洗涂。在一些實施例中，嚴(yán)格的雜交條件應(yīng)不允 許在20個連續(xù)核巧酸的延伸物上有兩個W上堿基不同的兩個核酸雜交。其它示例性嚴(yán)格 條件在所屬領(lǐng)域中是眾所周知的。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員理解如何評估并且調(diào)整雜交條件的 嚴(yán)格度W使得具有至少所希望水平的互補性的序列將穩(wěn)定雜交，而具有較低互補性的那些 將不會如此。關(guān)于雜交條件和參數(shù)的實例，參見例如薩布魯克等人，1989,分子克隆實驗指 南，第二版，冷泉港出版社，普萊恩維尤，紐