適用于提高胎兒體重增加并增強(qiáng)骨特性的可可堿組合物的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】適用于提高胎兒體重增加并增強(qiáng)骨特性的可可堿組合物
[000。 背景
[0002] 1.領(lǐng)域
[0003] 本披露設(shè)及W下組合物和方法，運(yùn)些組合物和方法用于在對(duì)其有需要的受試者中 增強(qiáng)骨形成、增加骨密度、增加內(nèi)部骨骼的互連、增加骨量、治療軟骨和/或骨缺損或其組 合，從而在孕前（preconception)、妊娠、哺乳和/或產(chǎn)后階段期間改善孕產(chǎn)婦和/或兒童健 康并且提高間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC;也稱(chēng)為"骨髓基質(zhì)細(xì)胞"或"多潛能性基質(zhì)細(xì)胞"）中的成 骨細(xì)胞/成骨活性。更具體地說(shuō)，所述組合物包含可可提取物。
[0004] 2.相關(guān)技術(shù)說(shuō)明
[0005] 可可堿（IUPAC名稱(chēng)：3, 7-二甲基-2, 3, 6, 7-四氨-1H-嚷嶺-2, 6-二酬；還被稱(chēng) 為3, 7-二甲基黃嚷嶺）是一種白色（或無(wú)色）苦味的結(jié)晶粉末，具有290°C至295°C的升華 點(diǎn)、357°C的烙點(diǎn)W及180. 16g/mol的分子量?？煽蓧A在水中的溶解度是1. 0g/2L;在沸水中 的溶解度是1. 0g/150mU并且在95%乙醇中的溶解度是1.Og/2. 2L?？煽蓧A與咖啡因和茶 堿化學(xué)上相關(guān)，并且存在于眾多食物中，運(yùn)些食物包括巧克力、可可、茶葉、W及己西替。可 可堿、茶堿（1,3-二甲基黃嚷嶺）化及咖啡因（1，3,7-S甲基黃嚷嶺）的化學(xué)結(jié)構(gòu)分別如 W下化學(xué)式I、IIW及III所給出。
[0006]
[0007] 可可堿^從約1.5%至約3%的濃度天然存在于可可豆（可可〇116〇13'〇111曰 cacao))中，并且W從約0. 7%至約1. 2%或約15至約30g/Kg的濃度天然存在于可可豆的 殼中（溫霍爾茨（Winholdz)，1983)。雖然是同一化學(xué)家族的部分，但是人們必須區(qū)分可可 堿的刺激作用與咖啡因的刺激作用。咖啡因作用相對(duì)較快，并且它對(duì)人的主要作用是提高 精神警覺(jué)性；可可堿的作用更為微妙，并且引起比咖啡因更溫和更持久的情緒高漲。在血流 中，可可堿的血漿半衰期（ti/2)是六小時(shí)，而咖啡因的血漿半衰期僅是兩小時(shí)。另一個(gè)區(qū)別 是，可可堿不是生理成癒性的，從而在長(zhǎng)期定期攝入之后不會(huì)產(chǎn)生戒斷癥狀，而咖啡因已被 證明是生理成癒性的并且與許多已證明的戒斷情況相關(guān)。
[0008] 如在此所用，"可可堿"是指可可堿、可可堿的鹽或復(fù)鹽、或包含可可堿的共晶體。
[0009] 在20世紀(jì)80年代進(jìn)行的兩項(xiàng)獨(dú)立研究發(fā)現(xiàn)，8個(gè)品種的商業(yè)可可粉中可可堿的平 均水平是1. 89% (夏夫利和塔卡（Shively&Tarka)，1984和澤馬斯狂oumas)等人，1980)。 特別相關(guān)的是W下表1中所示的可商購(gòu)的食品中存在的可可堿的正常水平。
[0010]
[0011] 來(lái)源：澤馬斯等人，1980 ;布勞克和塔卡度lauch&Tarka)，1983 ;夏夫利和塔卡， 1984 ;克雷格與阮（Craig&Nguyen)，1984。
[0012] *可可堿含量通過(guò)HPLC/反相柱色譜法測(cè)定
[0013] 在任何類(lèi)型的巧克力中，黑巧克力含有最高水平的可可堿/份，但濃度傾向于在 約0. 36%與約0. 63%之間變化。為了用表1中提及的食品正確理解運(yùn)種情況，一盎司黑巧 克力條含有約130mg可可堿，而一盎司牛奶巧克力條含有約44mg可可堿。因此，一盎司黑 巧克力條中可可堿的濃度是一杯5盎司熱巧克力中的量的大約兩倍。對(duì)于一個(gè)143磅的人 來(lái)說(shuō)，要在其血液中達(dá)到可可堿的毒性水平，他們將必須一次攝取大約86個(gè)一盎司牛奶巧 克力條。
[0014] 可可堿也可W作為胺鹽（例如，其乙二胺鹽）或其復(fù)鹽（例如，與有機(jī)酸的堿金屬 鹽或堿±金屬鹽，例如，乙酸、葡糖酸、苯甲酸或水楊酸的堿金屬或堿±金屬鹽）分離或產(chǎn) 生?？蒞制備運(yùn)些復(fù)鹽W使得可可堿更具水溶性抑或W制得不溶性絡(luò)合物。
[001引在1966年，斯特羅爾福什巧城1拉rs)報(bào)道了用富含巧克力的飲食喂食的倉(cāng)鼠中 離齒減少。斯特羅爾福什的研究通過(guò)比較可可粉、脫脂可可粉W及可可脂檢查了對(duì)倉(cāng)鼠離 齒的作用。當(dāng)可可粉構(gòu)成倉(cāng)鼠飲食的20%、10%、5%w及2%百分比時(shí)，純可可粉對(duì)應(yīng)地 抑制84 %、75 %、60 %、W及42 %的離齒。脫脂可可顯示出比含脂可可粉顯著更高的抗離 作用，但單獨(dú)的可可油（構(gòu)成倉(cāng)鼠飲食的15%)顯著增加了離齒（斯特羅爾福什A."透 析、退較或碳處理的可可水提取物對(duì)倉(cāng)鼠離齒的作用"（"EffectonHamsterCariesby Dialyzed,DetannedorCarbon-treatedWater-ExtractofCocoa") 口腔生物學(xué)文獻(xiàn) (ArchOralBiol.) 1966;11:609-15)。
[0016] 在一個(gè)隨訪(fǎng)研究中，斯特羅爾福什研究了可可粉的脫脂部分，并且證實(shí)用水洗涂 的可可粉具有比未洗涂的可可粉顯著更小的抗致離作用。然而，斯特羅爾福什仍在洗涂的 可可粉組中觀(guān)察到顯著的抗離作用，"指示非水溶性防離因子的存在"并且提到"可可中兩 種離齒-抑制性物質(zhì)的存在：一種是水溶性的并且另一種是微溶于水的"（斯特羅爾福什， A. ，1966)。
[0017] 后續(xù)研究表明在存在可可堿時(shí)體外生長(zhǎng)的憐灰石晶體顯著大于在不存在可可堿 時(shí)生長(zhǎng)的那些（參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,919, 426和6, 183, 711，運(yùn)些專(zhuān)利各自通過(guò)引用W其全部?jī)?nèi)容結(jié)合）。哺乳期大鼠的可可堿攝取與暴露于可可堿的哺育期幼鼠的整個(gè)第一顆 磨牙中徑憐灰石微晶大小增加（更高結(jié)晶度）（與對(duì)照相比）W及抗酸溶解性的提高相關(guān) (參見(jiàn)同上）。暴露于可可堿的哺育期雌性幼鼠的股骨比性別匹配的對(duì)照證實(shí)更高結(jié)晶度， 并且更堅(jiān)固且更堅(jiān)硬；然而，雄性幼鼠的股骨未顯示出運(yùn)種關(guān)系（參見(jiàn)同上）。
[001引然而，化11-Petch關(guān)系指示，固體材料對(duì)永久變形的抗性（例如，其壓痕硬 度）在顆粒大小減小時(shí)提高。因此，在暴露于可可堿后觀(guān)察到的徑憐灰石結(jié)晶度的提 高一一與化11-Petch關(guān)系一起一一表明骨骼和牙齒對(duì)壓痕和永久變形的抗性將在暴 露于可可堿之后由于更大的晶體大小而應(yīng)該降低。該結(jié)論在近期工作中得到了支持， 證實(shí)"當(dāng)晶粒大小從亞微米減少至納米時(shí)，[徑憐灰石]的硬度遵循化11-Petch關(guān) 系"（王J.等人"硬度和粗糖度同時(shí)增強(qiáng)的納米結(jié)晶徑憐灰石"（"Nanoc巧stalline hydroxyapatitewithsimultaneousenhancementsinhardnessandtoughness"）生 物材料度1〇111曰*6'1曰13.)2009;30:6565-72)。另一項(xiàng)研究表明徑憐灰石的"硬度"與顆 粒大小關(guān)系不大，從而表明隨著晶粒大小減小，硬度幾乎無(wú)變化，但表明徑憐灰石的"斷 裂初度"隨著顆粒大小減小而提高（馬扎赫瑞M(Maz址eriM)等人，"一種新型燒結(jié)工 藝對(duì)徑憐灰石陶瓷的機(jī)械特性的作用"（"Effectofanovelsinteringprocesson mechanicalpropertiesofhydroxyapatiteceramics.")合金與化合物雜志（J.Alloys Compd.)2009;471:180-4)。一項(xiàng)人恒牙和乳（嬰兒）牙的研究證實(shí)，"當(dāng)與恒牙相比較時(shí)， 嬰兒牙釉質(zhì)更薄、更軟、更易斷裂并且具有更大[徑憐灰石]晶粒"（洛IM化OWIM)等人 "繪制人類(lèi)牙齒的結(jié)構(gòu)、組成W及機(jī)械特性"（"Mappingthestructure,compositionand mechanicalpropertiesofhumanteeth.")材料科學(xué)與工程，C輯：生物材料應(yīng)用（Mater SciE；ngCMaterBiolApp.) 2008;28:243-47)。
[0019] 由于運(yùn)類(lèi)沖突和矛盾的結(jié)果，人們無(wú)法推斷已知的特性并且用于預(yù)測(cè)可靠或準(zhǔn)確 結(jié)果的徑憐灰石對(duì)環(huán)境因素的反應(yīng)無(wú)法僅通過(guò)評(píng)價(jià)現(xiàn)有技術(shù)和推斷某個(gè)結(jié)果來(lái)預(yù)測(cè)。
[0020] MSC的特征在于它們能夠產(chǎn)生子代干細(xì)胞W及分化成許多不同細(xì)胞類(lèi)型，包括但 不限于：成骨細(xì)胞、支持血細(xì)胞生成和破骨細(xì)胞生成的基質(zhì)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、骨髓的 脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、W及P-膜島細(xì)胞。因此，MSC提供終生骨發(fā)育、骨重塑W及血細(xì)胞生 成所需的成骨細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞。
[0021] 在人類(lèi)中，骨形成開(kāi)始于胎兒發(fā)育的前6至8周期間。間充質(zhì)來(lái)源的祖干細(xì)胞遷移 至預(yù)定部位，其中它們：(a)凝聚、增殖并且分化成骨形成細(xì)胞（成骨細(xì)胞），在煩骨中觀(guān)察 到并且被稱(chēng)為"膜內(nèi)骨形成"的一種過(guò)程；抑或化）凝聚、增殖并且分化成作為中間體的軟 骨形成細(xì)胞（成軟骨細(xì)胞），運(yùn)些中間體隨后被骨形成細(xì)胞代替。更確切地說(shuō)，間充質(zhì)干細(xì) 胞分化成軟骨細(xì)胞。然后軟骨細(xì)胞變得巧化、經(jīng)歷過(guò)度生長(zhǎng)并且被由現(xiàn)存在于該部位的分 化的成骨細(xì)胞組成的新形成的骨骼所代替。接著，礦化的骨骼廣泛重塑，其后變得被一種充 滿(mǎn)功能性骨髓元素的聽(tīng)骨所占據(jù)。該過(guò)程在長(zhǎng)骨中觀(guān)察到并且被稱(chēng)為"軟骨內(nèi)骨形成"。在 后胎兒期，骨能夠在損傷時(shí)通過(guò)模擬胚胎軟骨內(nèi)骨發(fā)育的細(xì)胞過(guò)程而自我修復(fù)。也就是說(shuō)， 來(lái)自骨髓、骨膜W及肌肉的間充質(zhì)祖干細(xì)胞可被誘導(dǎo)W遷移至缺損部位并且開(kāi)始上述級(jí)聯(lián) 事件。它們?cè)谀抢锓e累、增殖并且分化成軟骨，該軟骨隨后被新形成的骨骼代替。
[0022] MSC在骨髓中是極稀少的，并且由曬齒類(lèi)動(dòng)物或人類(lèi)骨髓體外擴(kuò)增運(yùn)些MSC的早 期嘗試已證明是困難的。此外，誘導(dǎo)祖細(xì)胞的增殖并分化成功能性骨骼、軟骨、肌腫和/或 初帶組織已顯示出需要多種蛋白質(zhì)，包括但不限于：骨形態(tài)發(fā)生蛋白度M巧家族成員和生 長(zhǎng)因子的TGF-P超家族成員。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)更大、更復(fù)雜并且由活細(xì)胞合成，所W運(yùn)類(lèi)蛋白 質(zhì)的制造、分離W及純化必然比小分子化學(xué)化合物要更復(fù)雜、更昂貴。
[0023] 因此，仍然存在對(duì)能夠誘導(dǎo)祖細(xì)胞增殖成功能性骨骼、軟骨、肌腫和/或初帶組織 的小分子化學(xué)化合物（尤其是已知無(wú)毒性的那些）的需要。
[0024] 在權(quán)利要求書(shū)中表征的實(shí)施例提供了運(yùn)種技術(shù)問(wèn)題的解決方案。
[00巧]概述