調(diào)節(jié)植物種子和蜜腺內(nèi)含物的方法
【專利說明】調(diào)節(jié)植物種子和蜜腺內(nèi)含物的方法
[0001] 關(guān)于聯(lián)邦資助的研究或研發(fā)的聲明
[0002] 研發(fā)本發(fā)明期間進(jìn)行的部分工作利用了在能源部項(xiàng)目編號DE-FG02-04ER15542 和美國國家科學(xué)基金會(huì)項(xiàng)目編號0820730下的美國政府基金。美國政府對本發(fā)明有某些權(quán) 利。
[000引序列表信息
[0004] 一種計(jì)算機(jī)可讀文本文件，題為"056100-5093-W0-SequenceListing(序列 表）.txt,"在2014年3月12日當(dāng)天或當(dāng)天左右創(chuàng)建，其中約923化的文件大小包含用于 本申請的序列表并且借此將其通過引用W其全文結(jié)合。
[000引發(fā)明背景 發(fā)明領(lǐng)域
[0006] 本發(fā)明涉及增加植物的發(fā)育種子中的至少一種糖的水平的方法，其中該些方法包 括在植物細(xì)胞中插入編碼至少一種糖轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白（SWEET蛋白）的外源核酸W產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因 植物細(xì)胞，并且使該轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞經(jīng)受促進(jìn)在種子發(fā)育過程中表達(dá)該至少一種SWEET蛋 白的條件。該些方法導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物種子、W及產(chǎn)生種子的轉(zhuǎn)基因植物，其中如與來自在相 同條件下生長的相同物種的非轉(zhuǎn)基因植物的種子相比，至少一種糖的水平是增加的。
[0007] 發(fā)明背景
[0008] 通過植物攔截光、將光束縛為化學(xué)能、并且最終在收獲器官中制造膽存產(chǎn)物的效 率來確定產(chǎn)量潛為。糖類是該些轉(zhuǎn)換中的主導(dǎo)通貨，然而，從薦糖到達(dá)終端初皮部末端（進(jìn) 入發(fā)育的種子中）W及隨后導(dǎo)致種子填充的轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)化步驟的路徑，是屬于能量轉(zhuǎn)化鏈中 最少了解的部分。
[0009] 在大多數(shù)植物中，薦糖是從來源易位至庫組織的碳水化合物的主要形式。薦糖是 主要在葉細(xì)胞中經(jīng)由一對酶（薦糖憐酸合酶和薦糖憐酸憐酸酶）合成的，并且然后是通過 SWEET家族的薦糖轉(zhuǎn)運(yùn)體輸出到質(zhì)外體（apoplasm)中，并且隨后在洲T家族的薦糖/H+共轉(zhuǎn) 運(yùn)體的幫助下，輸入脈管系統(tǒng)中。假定在初皮部中對薦糖易位的驅(qū)動(dòng)為是由薦糖進(jìn)入脈管 的主動(dòng)輸入產(chǎn)生并由此產(chǎn)生滲透梯度和壓為驅(qū)動(dòng)流，并且SWEET供給洲T。碳分配的至少了 解的領(lǐng)域之一是初皮部卸載，并且確切地是糖類從母體初皮部向發(fā)育的胚和胚郭轉(zhuǎn)移。在 豆類中，假定初皮部卸載后是經(jīng)由胞間連絲共質(zhì)體地發(fā)生的，隨后薦糖從種皮經(jīng)由難W捉 摸的流出轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)構(gòu)從種皮流出。在洲T家族的薦糖/H+共轉(zhuǎn)運(yùn)體的幫助下，發(fā)育的豆類胚 攝取薦糖。在魏豆的發(fā)育的胚中的洲T1過表達(dá)導(dǎo)致增加的薦糖流入，表明在大型種子雙子 葉植物中，通過增加進(jìn)入胚的主動(dòng)流入，是存在增加產(chǎn)量的潛為的。通過經(jīng)由轉(zhuǎn)化酶和薦糖 合酶薦糖至己糖和活化己糖的酶法轉(zhuǎn)化，連同通過合成淀粉和其他儲(chǔ)存化合物來消耗該些 產(chǎn)物，進(jìn)一步驅(qū)動(dòng)在胚中碳水化合物的的積累。
[0010] 在基底胚郭轉(zhuǎn)移層巧ETL)中的薦糖-代謝酶（例如細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶（Mnl))W及在 胚郭中的薦糖合酶（SuSy)還在碳轉(zhuǎn)移中起到關(guān)鍵作用。該一兩步降解是表示在轉(zhuǎn)化為淀 粉之前，胚郭中的薦糖的重新合成。然而迄今為止，并且盡管在決定產(chǎn)量中它具有關(guān)鍵作 用，在玉蜀泰巧粒中糖轉(zhuǎn)移和代謝的路徑仍有些不清楚。關(guān)于在該一重要器官中，驅(qū)動(dòng)糖類 的積累的膜轉(zhuǎn)運(yùn)體，所知甚少。
[0011] 在細(xì)胞的、亞細(xì)胞的、組織的、和整個(gè)生物體的水平上，代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)是密切關(guān)聯(lián)的。 雖然在植物系統(tǒng)中代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)網(wǎng)絡(luò)的大多數(shù)建模已經(jīng)集中在細(xì)胞水平，對于哺郭動(dòng)物系 統(tǒng)，很好地建立了在組織水平上的整合轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝生產(chǎn)、消耗和儲(chǔ)存的模型。腦、屯、臟W及 肝模型已經(jīng)成功整合多種轉(zhuǎn)運(yùn)的代謝物，該些代謝物經(jīng)歷了通過細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的若干組 織隔室中的若干個(gè)通路的關(guān)聯(lián)的代謝步驟的代謝。建立的理論框架、連同現(xiàn)代計(jì)算硬件和 軟件工具，允許捕獲底物和產(chǎn)物的組織水平轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵特征的模型的數(shù)值解和測 試。
[0012] 若干公開的植物研究已經(jīng)至不同程度整合了轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝和/或儲(chǔ)存?？臻g的和發(fā) 展的生長素轉(zhuǎn)運(yùn)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的詳細(xì)建模已經(jīng)很好地闡明了分生組織生長的激素調(diào)節(jié)。在甘 薦中薦糖轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝和儲(chǔ)存的公開模型導(dǎo)致控制點(diǎn)的鑒定，并且通過轉(zhuǎn)基因操作，鑒定并且 經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了用于增加至薦糖的流的祀標(biāo)。
[001引發(fā)明概述
[0014] 本發(fā)明涉及增加植物的發(fā)育種子中的至少一種糖的水平的方法，其中該些方法包 括在植物細(xì)胞中插入編碼至少一種糖轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白（SWEET蛋白）的外源核酸W產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因 植物細(xì)胞，并且使該轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞經(jīng)受促進(jìn)在種子發(fā)育過程中表達(dá)該至少一種SWEET蛋 白的條件。該些方法導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物種子、W及產(chǎn)生種子的轉(zhuǎn)基因植物，其中如與來自在相 同條件下生長的相同物種的非轉(zhuǎn)基因植物的種子相比，至少一種糖的水平是增加的。
[0015] 附圖簡要說明
[0016] 圖1描繪了SWEET9,即薦糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，對于花蜜分泌而言是必需的。a-b，在非洲爪 贍卵母細(xì)胞中進(jìn)行；AtSWEET9、和化SWEET9的薦糖攝?。╝)W及流出化）活性。截短的 AtSWEET9_F201*(AtSWEET9m)和化SWEET9_L201* 巧rSWEET9m)用作陰性對照。a,卵母細(xì)胞 攝取測定；SW邸T9和SW邸T9介導(dǎo)％薦糖攝取（ +SEM，n> 14)，*t顯著（P〈0. 05)，顯 著（P〈0. 01)。b，卵母細(xì)胞流出測定；在非洲爪贍卵母細(xì)胞中，用"C薦糖注射，通過SWEET9 和SWEET9的"C薦糖流出（±SEM，n> 8)。C，依附至寧片內(nèi)部的花蜜滴（野生型）。d-e， 在swee巧-1和swee巧-2突變體的蜜腺中，花蜜的缺失。f，從包含額外拷貝的SWEET9-eGFP 的花的蜜腺中分泌的增加的花蜜。g-h，在它的天然啟動(dòng)子下，從補(bǔ)足的atswee巧突變體的 蜜腺分泌的花蜜；SWEET9(g)或SWEET9-eGFP化）。
[0017] 圖2描繪了在swee巧突變體中，SW邸T9和淀粉積累的細(xì)胞的和亞細(xì)胞的定位。 a-d，在表達(dá)SWEET9的翻譯GUS融合體的擬南芥花中的組織化學(xué)GUS分析（天然啟動(dòng)子）。 示出SWEET9的組織特異性定位的擬南芥花的側(cè)向（a)和中間蜜腺化）、c-d橫切面（C)W 及縱斷面（d)中的抓S染色。用番紅-0染色細(xì)胞壁（樓色）。e，proSWEET9的eGFP巧光 的共聚焦圖像；SWEET9-eGFP融合體，示出在質(zhì)膜和高爾基體處的亞細(xì)胞定位。f-g，在天亮 后4小時(shí)用路戈?duì)柵踩芤夯痷gol'Siodinesolution)染色的野生型（f)和swee巧-1突 變體（g)的花；swee巧-1的花柄中的淀粉。h-i,野生型和swee巧-1的蜜腺的特寫鏡頭。淀 粉僅在野生型蜜腺的保衛(wèi)細(xì)胞中W及在swee巧-1中的蜜腺薄壁組織中積累（在黑暗結(jié)束 時(shí)采樣）。j-k，用路戈?duì)柵踩芤喝旧?，在野生型和swee巧-1突變體中擬南芥蜜腺的LR白樹 脂切片。在swee巧-1突變體的蜜腺中（k)和在野生型蜜腺的氣孔中（j，*)淀粉粒（暗紅 色）積累。在開花時(shí)，在野生型和swee巧突變體株系中，在花柄和蜜腺中的淀粉粒。用番 紅-0染色細(xì)胞壁（樓色）。
[0018] 圖3描繪了對于擬南芥的花蜜分泌而言，薦糖憐酸合酶1 (SPS1)和SPS2是必需 的。a-b，SPSl和SPS2基因表達(dá)的人工微RNA抑制導(dǎo)致蜜腺分泌的喪失。箭頭指示由野生 型花分泌的花蜜。c-d，與野生型相比，SPS1和SPS2基因表達(dá)的微RNA抑制改變了蜜腺中 的淀粉積累。淀粉在spslf/2f突變體株系的花柄中積累（紅色箭頭），并且僅在野生型蜜 腺的保衛(wèi)細(xì)胞中積累。e，針對蜜腺分泌機(jī)制提出的模型：在蜜腺中，通過SPS合成淀粉衍生 的薦糖，并且通過SW邸T9輸出淀粉衍生的薦糖。隨后，通過CWINV4水解輸出的薦糖，該產(chǎn) 生了高滲透勢W維持水流沿著滲透梯度向下。
[0019] 圖4描繪了對于花蜜分泌而言，憲菁中的SWEET9 (化SWEET9)和野生煙草 的.attenuata)中的SWEET9的aSWEET9)是至關(guān)重要的。a,在野生型憲菁花的側(cè)向蜜腺 中的花蜜滴。b和C，在brswee巧-1和brswee巧-2突變體中花蜜的缺失。d,在野生煙草 中化SW邸T9轉(zhuǎn)錄物積累。e，在野生型的、naswee巧-1的和naswee巧-2的植物中，在5am 測量的花的平均花蜜體積（ +SEM)。f和g，在卵母細(xì)胞中，化SWEET9的薦糖攝取（f)W 及流出（g)活性。將化SWEET9_L201*的aSWEET9m)的截短形式用作對照。f，卵母細(xì)胞 攝取；NaSWEET9介導(dǎo)％薦糖攝?。ā繱EM，n> 14)，顯著（P〈0. 01)。g，在卵母細(xì)胞 中，通過化SWEET9的％薦糖流出（ +SEM，n> 8)。h，數(shù)據(jù)收集自可獲得的基因組數(shù)據(jù) 庫（phytozome.org，genomevolution.org，bioinformatics,psb.ugent.be/plaza/)，使用 SW邸T9蛋白質(zhì)序列作為誘巧，同時(shí)使用genomevolution.0巧作為參照產(chǎn)生樹，并且然后相 應(yīng)地用戴維斯瓜ivies)等人（美國科學(xué)院院刊（Proc化tlAcadSciUSA. )2004年2 月17日，101(7) : 1904-9)中示出的結(jié)果進(jìn)行了確認(rèn)。樹分支是示意性表示并且它們不是由 任何真實(shí)自展值化oots化apvalue)限定。屬于菩薇類或菊類的核屯、真雙子葉植物分支的 物種分別加了樓色和黃色的下劃線。
[0020] 圖5描繪了在擬南芥中，SWEET的種皮表達(dá)和突變體表型。（A)SWEETll-GFP。脅 在細(xì)AF，在野生型胚中的淀粉。（C)sweetll、12、15的=突變體巧DAF)示出了遲緩的發(fā)育 和降低的淀粉含量。
[0021] 圖6描繪了在煙草中，SWEET4a、SWEET4b、SWEET4d和SWEET11的GFP融合體定位在 質(zhì)膜。在農(nóng)桿菌浸潤的本氏煙葉子中的瞬時(shí)表達(dá)證明了在質(zhì)膜處WEET4a、SWEET4b、SWEET4d 和SWEETIUGFPC-末端融合體）的強(qiáng)定位。在農(nóng)桿菌浸潤3天后，使用共聚焦激光掃描顯 微術(shù)將巧光信號可視化。
[0022] 圖7描繪了（A)SWEET4a和SWEET4b(來自王蜀泰）作為己糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能，W及 巧)SWEET11 (來自王蜀泰）作為薦糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能。通過在肥K293T細(xì)胞中與胞質(zhì)FRET 葡萄糖或薦糖傳感器（分別是化IPglu600iiD13V和化IPsuc90mAlV)共表達(dá)，鑒定葡萄糖 或薦糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性。通過CFP和維納斯發(fā)射（Venusemission)的定量比率成像（采集間隔 10s)，對單獨(dú)的細(xì)胞進(jìn)行分析。用培養(yǎng)基灌流共轉(zhuǎn)染的肥K293T細(xì)胞，隨后用2mM-5mM-20mM 葡萄糖的脈沖或lOmM薦糖進(jìn)行灌流。將僅用傳感器轉(zhuǎn)染的肥K293T細(xì)胞（"對照"）作為 對照。SWEET4d是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，例如SWEET4a和4b。
[0023] 圖8描繪了在玉米中，SWEET4d的插入等位基因突變體。（A)示出了 15DAP巧粒表 型，其中野生型在左側(cè)，并且突變體在右側(cè)；該突變體示出，與野生型巧粒相比，在大小/重 量方面，總體下降了約60%。（B)示出了野生型（左側(cè)）和突變體（右側(cè)）的巧粒的矢狀 切口；胚和胚郭二者都顯現(xiàn)是嚴(yán)重受該sweet4d突變影響，同時(shí)該母體果皮塌陷，示出"空 果皮"表型。（C)示出了對于插入等位基因而言雜合的玉米植物（左側(cè)）W及對于插入等 位基因而言的純合植物（右側(cè)）。（D)將插入等位基因（增變基因）攜帶進(jìn)入最后的外顯 子的構(gòu)建體的示意圖。（巧示出了突變體（左側(cè)）和野生型（右側(cè)）玉米巧粒的IKI淀粉 染色；在野生型條件下，淀粉是大部分積累在胚郭和進(jìn)入根分生組織的少數(shù)谷粒內(nèi)W維持 早期發(fā)芽。在突變體中，胚郭仍然積累淀粉，但是其大小被嚴(yán)重影響，并且大部分的該淀粉 顯現(xiàn)是被儲(chǔ)存進(jìn)胚中。
[0024] 圖9描繪了在攜帶驅(qū)動(dòng)SWEET-GFP的天然啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因擬南芥的發(fā)育的種子 中，SWEET11和15各自的局部表達(dá)。
[0025] 圖10描繪了在細(xì)AF(開花后天數(shù)），野生型（對照）、單突變體（sweetlS)、雙突變 體（sweetll、12，sweetll、15)和S突變體（sweetll、12、l巧間的胚表型的比較。雙突變體 sweetll、12和sweetll、15的胚示出比對照略微更小。=突變體sweetll、12、15極大地延 遲了胚生長
[0026] 圖11描繪了在8和11DAF該兩種情況下，野生型（對照），單突變體（sweetlS)， =突變體（sweetll、12、15)和雙突變體（sweetll、12)的胚中，淀粉積累的比較。在用路戈 爾挪溶液染色長角果日min并且用水洗漆兩次后，將胚切開W拍照。來自=突變體sweetll、 12、1日的胚積累了比sweetll、12或?qū)φ崭俚牡矸?，并且來自sweetll、12的胚具有比 sweetll、12、15更多的淀粉，比對照更少的淀粉
[0027] 圖12描繪了 23個(gè)玉蜀泰SWEET和來自擬南芥（At)的17個(gè)SWEET家族成員的系 統(tǒng)發(fā)育分析。為了進(jìn)一步研究玉蜀泰和擬南芥SWEET的關(guān)系，使用通過化ytozome.net非 冗余蛋白數(shù)據(jù)庫的Bias巧檢索獲得的來自擬南芥的最接近的氨基酸序列，構(gòu)建了進(jìn)化樹 (MEGA5. 1)。該樹證明了玉蜀泰SWEET也落入了如在擬南芥中限定的SWEET4分支中。
[0028] 圖13描繪了玉蜀泰中的SWEET4a、4b和4d的氨基酸比對。星號表示保守的氨基 酸。貫穿所有序列，都觀察到非常高的同源性，但是在C-末端內(nèi)急劇減少。
[0029] 圖14描繪了在種子發(fā)育的不同階段，不同SWEET的表達(dá)。在該一圖中，發(fā)育模式 遵從擬南芥SWEET表達(dá)。縮與；A,缺失；INS,生物學(xué)復(fù)制品之間的不一致檢測；M,邊緣的； P，存在。階段和組織/隔室的縮寫；階段；P化地-前球形期；化地-球形期；HRT-屯、形期； LC0T-線性子葉期；MG-成熟綠色期。組織；CZE-合點(diǎn)端胚郭；CZSC-合點(diǎn)端種皮；EP-胚體； GSC-普通種皮；:MCE-珠孔端胚郭；PEN-周圍胚郭；S-胚柄；WS-完整種子。使用MAS5. 0 算法產(chǎn)生了信號強(qiáng)度（相對mRNA)和信號檢測鳴叫（signaldetectioncalls) (P、A、或M)。 為了比較的目的，使用MAS5. 0缺省參數(shù)，對于芯片上的所有探針組，將基因芯片數(shù)據(jù)全局 地縮放至500的目標(biāo)強(qiáng)度。基于RNA樣品的兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)的MAS5.0檢測鳴叫，為每個(gè) 探針組手動(dòng)分配合意的檢測鳴叫。在兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)中具有相同信號檢測鳴叫的探針組被 分別分配P、A、或M的合意的檢測鳴叫。相比之下，對于兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)（例如P和A;P和 M)，具有不同的或不整一的檢測鳴叫的探針組被分配不足（INS)的合意的檢測鳴叫。
[0030] 圖15描繪了在早期種子發(fā)育階段中，SWEET12的翻譯表達(dá)。通過共聚焦顯微鏡， 在種皮和胚柄中觀察到GFP信號。
[003。圖16描繪了在種子的不同發(fā)育階段中，SWEET15的翻譯表達(dá)。SWEET15定位至種 皮的最外層的PM。在線性子葉階段，在胚郭中，也將GFP信號可視化。
[003引圖17描繪了在卵母細(xì)胞中，SWEET1U12和15攝取薦糖的能為。將SWEET1U12和 15的cRNA注射到卵母細(xì)胞中。在2天的表達(dá)后，測量"C薦糖攝取。
[003引圖18描繪了在SWEET11、12和15的王突變體中，被延遲的擬南芥胚發(fā)育。王突變 體sweetll、12、l日的胚主要是自日DAF獲取。通過差示干涉差化1C)顯微鏡，在不同階段， 在干凈的種子中獲取圖像
[0034] 圖19描繪了SWEET11、12和15的=突變體的種子產(chǎn)量比在野生型擬南芥中的要 低。sweetll、12突變體具有比對照更低并且比sweetll、12、15更高的種子產(chǎn)量。Sweetll、 12、15或sweetll、12并不影響每個(gè)長角果的種子數(shù)。
[0035] 圖20描繪了在5天齡的幼苗中，當(dāng)將薦糖添加至生長培養(yǎng)基時(shí)，薦糖部分地解救 王突變體（SWEET1U12和15)的根生長的能為。
[0036] 圖21描繪了在擬南芥=突變體（SWEET11、12、15)中，被嚴(yán)重?fù)p傷的種子發(fā)育的母 本對照。（A)在細(xì)AF，雜交的兩種對照植物示出正常的種子發(fā)育。（B)將母本對照與父本 王突變體雜交，并且在細(xì)AF，所得種子顯現(xiàn)出發(fā)育正常。（C)將父本對照與母本王突變體雜 交，并且在細(xì)AF，所得種子的發(fā)育被嚴(yán)重?fù)p害。（D)將父本王突變體與母本王突變體雜交， 并且在細(xì)AF，所得種子的發(fā)育被嚴(yán)重?fù)p害。（巧示出發(fā)育的幼苗的表面區(qū)域。
[0037] 圖22描繪了在玉蜀泰突變體中，SWEET11的上調(diào)，其中淀粉生物合成/積累是有缺 陷的。野生型；aeWX-直鏈淀粉增加子/蠟雙突變體；shl-shruken(縮?。?1突變體。值 是在對數(shù)標(biāo)度上。底部圖中的構(gòu)建體是基因SWEET11和通過再動(dòng)員內(nèi)源DS易位子產(chǎn)生的 2個(gè)插入等位基因化S-ANT和DS-ALV)的示意性表示。
[0038] 圖23描繪了在玉蜀泰中，在用羊毛脂和赤霉酸（GAs)處理3天的葉子中SWEET11 的上調(diào)。用羊毛脂和GAs的混合物涂布嫩葉巧周）持續(xù)4天。然后去除羊毛脂和GA3,W 改進(jìn)RNA提取。使用18S基因作為內(nèi)標(biāo)，來進(jìn)行qPCR。值表示通過內(nèi)標(biāo)歸一化的SWEET11 的相對表達(dá)。
[0039] 圖24描繪了野生型和sweet4d突變體初皮部末端和肥化的矢狀截面。將超薄 (Im)切片放在飽和IKI溶液中30min進(jìn)行淀粉染色。黑點(diǎn)是淀粉粒，并且它們化先積累在 sweet4d玉蜀泰突變體的母本初皮部末端內(nèi)。
[0040] 圖巧描繪了在SWEET4d玉蜀泰突變體中異常的基底胚郭轉(zhuǎn)移層巧ETL)形態(tài)學(xué)， 其中沒有可見的細(xì)胞壁向內(nèi)生長或細(xì)胞組織。用番紅將切片染色至高亮細(xì)胞壁形態(tài)學(xué)。
[0041] 圖26描繪了示出保守氨基酸序列的多個(gè)擬南芥SWEET的序列比對數(shù)據(jù)的網(wǎng)絡(luò)標(biāo) 志（weblogo)。在網(wǎng)絡(luò)標(biāo)志中字母的大小表示不同SWEET間氨基酸序列的保守程度。
[0042] 圖27描繪了示出保守氨基酸序列的多個(gè)擬南芥SWEET的序列比對數(shù)據(jù)的網(wǎng)絡(luò)標(biāo) 志（weblogo)。在網(wǎng)絡(luò)標(biāo)志中字母的大小表示不同SWEET間氨基酸序列的保守程度。
[0043] 發(fā)明詳細(xì)說明
[0044] 本發(fā)明涉及增加植物的發(fā)育種子中的至少一種糖的水平的方法，其中該些方法包 括在植物細(xì)胞中插入編碼至少一種糖轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白（SWEET蛋白）的外源核酸W產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因 植物細(xì)胞，并且使該轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞經(jīng)受促進(jìn)在種子發(fā)育過程中表達(dá)該至少一種SWEET蛋 白的條件。該些方法導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物種子、W及產(chǎn)生種子的轉(zhuǎn)基因植物，其中如與來自在相 同條件下生長的相同物種的非轉(zhuǎn)基因植物的種子相比，至少一種糖的水平是增加的。
[0045] SWEET蛋白一般屬于PFAM家族"MtN3_slv"(登錄號PF03083)。參見p扣m.sanger. ac.uk，它是通過多重序列比對和隱蔽馬爾科夫模型（HMM)確定和表示的蛋白家族的數(shù)據(jù) 庫。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，在本發(fā)明的該些方法、構(gòu)建體、植物和植物種子中利用的 SWEET轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白是單向傳遞體，該是本領(lǐng)域熟知的術(shù)語，是指通過促進(jìn)擴(kuò)散來促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)的 蛋白，即隨溶質(zhì)梯度轉(zhuǎn)運(yùn)的被轉(zhuǎn)運(yùn)分子。通常單向傳遞體并不利用用于移動(dòng)它們所轉(zhuǎn)運(yùn)的 分子的能量，除了利用溶質(zhì)梯度。
[0046] SWEET蛋白是本領(lǐng)域熟知的，并且在多個(gè)數(shù)據(jù)庫中可W發(fā)現(xiàn)它們的一級氨基酸結(jié) 構(gòu)，該些數(shù)據(jù)庫包括但不限于植物膜蛋白數(shù)據(jù)庫（例如aramemnon.botan化.uni-koeln. de)、秀麗隱桿線蟲蛋白數(shù)據(jù)庫（例如WWW.wombase.org)、W及甚至人轉(zhuǎn)運(yùn)體數(shù)據(jù)庫（例 如WWW.tcdb. 〇巧）。一般SWEET具有不同于其他糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的特征分子結(jié)構(gòu)。例如，SWEET具 有與lac通透酶、酵母己糖轉(zhuǎn)運(yùn)體、人化UT或人SGLT不同的=維結(jié)構(gòu)。SWEET轉(zhuǎn)運(yùn)體的基 本單元是由=個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域CTM)組成的結(jié)構(gòu)域。在細(xì)菌中，具有3個(gè)TM的蛋白必須形成 至少一個(gè)二聚體，W產(chǎn)生糖轉(zhuǎn)運(yùn)孔。SWEET蛋白的真核生物形式包含由另外的TM結(jié)構(gòu)域分 開的該一亞基的重復(fù)。在家族成員中，該一另外的TM( "TM4")結(jié)構(gòu)域并不是保守的，因此 對于跨越SWEET蛋白界而正確發(fā)揮功能，該一結(jié)構(gòu)域的特定氨基酸序列并不是關(guān)鍵的。該 一另外的TM4結(jié)構(gòu)域用作將3個(gè)TM的兩個(gè)重復(fù)單位放入一個(gè)平行配置的反向接頭，該就是 如何與細(xì)菌蛋白一起形成二聚體的。該一 7TM結(jié)構(gòu)是與所有已知的糖轉(zhuǎn)運(yùn)體都不同的。該 些SWEET蛋白的動(dòng)物形式連同來自該一相同家族的細(xì)菌蛋白都轉(zhuǎn)運(yùn)糖，表明該些SWEET蛋 白的植物形式是糖轉(zhuǎn)運(yùn)體。
[0047] 通過保守氨基酸序列和結(jié)構(gòu)特征該二者，限定了SWEET轉(zhuǎn)運(yùn)體超家族的成員。例 如，所有SWEET都是由在嵌入串聯(lián)3TM重復(fù)單位中的兩個(gè)保守MtN3/唾液基序中分開的7 個(gè)TM組成，該些TM是通過更不保守的中屯、TM螺旋連接的，表明該一中屯、TM用作接頭。所 得結(jié)構(gòu)已經(jīng)被描述為3-1-3TMSWEET結(jié)構(gòu)。
[0048] 預(yù)測第一TM結(jié)構(gòu)域平均是由23個(gè)氨基酸（但是可W在20和巧之間變化）組成。 在該一TM結(jié)構(gòu)域內(nèi)，存在至少4種高度保守的氨基酸；G、P、T和F。
[0049] 預(yù)測第二TM結(jié)構(gòu)域平均是由19個(gè)氨基酸（但是可W在16和23之間變化）組成。 在該一TM結(jié)構(gòu)域內(nèi)，存在至少3種高度保守的氨基酸；P、Y和Y。
[0050] 預(yù)測第=TM結(jié)構(gòu)域平均是由23個(gè)氨基酸（但是可W在20和巧之間變化）組成。 在該一TM結(jié)構(gòu)域內(nèi)，存在至少3種高度保守的氨基酸；T、N和G。<