雜環(huán)蒽酮類組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑及其醫(yī)藥用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及一類雜環(huán)蔥酬類組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、 其制備方法及其醫(yī)藥用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 組蛋白甲基化修飾是一種重要的表觀遺傳學(xué)調(diào)控方式，參與染色質(zhì)構(gòu)象的調(diào)控、 基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。組蛋白的甲基化水平與多種原癌基因和腫瘤抑制基因密切相關(guān)，組蛋 白的甲基化水平的異常使得運(yùn)些原癌基因和腫瘤抑制基因非正常表達(dá)，可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤的 發(fā)生。因此，通過調(diào)節(jié)組蛋白的甲基化水平，某些重要基因得W轉(zhuǎn)錄，W達(dá)到治療腫瘤的目 的。組蛋白甲基化調(diào)節(jié)蛋白已成為目前腫瘤藥物研發(fā)領(lǐng)域最新、最熱口的祀標(biāo)。
[0003] 組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶主要的作用底物是組成核小體的組蛋白。在人體內(nèi)，組 蛋白末端的賴氨酸和精氨酸殘基會(huì)被甲基化。組蛋白精氨酸甲基化是由兩類甲基 轉(zhuǎn)移酶催化完成的：1類精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶和II類精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶。另一類組蛋 白甲基轉(zhuǎn)移酶主要作用于組蛋白的賴氨酸，稱作組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶化ysine meth^transferases,KMTs)。與其它的轉(zhuǎn)錄后修飾不同，組蛋白甲基化可W有二甲基化、 S甲基化，因此，甲基化的進(jìn)程更加復(fù)雜（MosammaparastN,ShiY.Reversalofhistone methylation:biochemicalandmolecularmechanismsofhistonedemethylases[J]. AnnuRevBiochem, 2010, 79:155-179.)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶能夠利用輔因子S-腺巧甲硫氨 酸（S-adenosylmethionine,SAM)作為甲基供體催化組蛋白N-端賴氨酸殘基，使其增加 1-3個(gè)甲基。到目前為止組蛋白賴氨酸的甲基化影響基因轉(zhuǎn)錄的具體機(jī)理尚未研究清楚，其 更多的生物學(xué)功能有待進(jìn)一步闡釋。組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶在眾多生理過程中發(fā)揮著重 要作用。例如，細(xì)胞的分化和發(fā)育，衰老過程的調(diào)節(jié)，基因組穩(wěn)定性的控制，神經(jīng)元功能的調(diào) 節(jié)和腫瘤細(xì)胞的增殖。組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶不僅可W作用于組蛋白，還可W使非組蛋白底物 甲基化。與癌癥相關(guān)的p53可W被KMTs甲基化。p53的373位賴氨酸甲基化后，減弱p53動(dòng) 態(tài)信號(hào)的傳遞，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不可控的生長(zhǎng)（WestLE,Gozani0.Regulationofp53 functionbylysinemethylation[J].E；pigenomics,2011, 3(3) :361_369)有研究表明，組 蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶在結(jié)腸癌，肝癌，乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)異常。此外，在白血病、前列腺癌、肺癌 和腮腺癌中都可觀察到組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的過表達(dá)。
[0004] 考慮到組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的重要功能，尤其是在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著至關(guān)重 要的作用，因此將組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶作為抗腫瘤祀標(biāo)是非常有前景的。目前報(bào)道的組蛋白 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑根據(jù)來源主要分為兩大類：一類為天然產(chǎn)物類抑制劑，一般是從真菌中 提取的抗生素類化合物。主要是毛殼素（chaetocin)類化合物，該類化合物包含有環(huán)二硫 酬贓嗦類結(jié)構(gòu)；另一類為人工設(shè)計(jì)合成的小分子抑制劑，目前報(bào)道的小分子抑制劑WSAM 的類似物居多，另有苯并咪挫類，哇挫嘟類化合物報(bào)道。
[0005] 組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑根據(jù)作用方式的不同分為底物競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑和SAM競(jìng) 爭(zhēng)性抑制劑。到目前為止組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的研究絕大多數(shù)處在臨床前階段。所W 研發(fā)選擇性的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，無(wú)論對(duì)學(xué)術(shù)研究還是對(duì)開發(fā)其臨床應(yīng)用的可能性 都具有非常重大的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明設(shè)及一類基于組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶設(shè)計(jì)的雜環(huán)蔥酬類的衍生物，藥理學(xué)實(shí)驗(yàn) 證明本發(fā)明化合物對(duì)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶從分子水平到細(xì)胞水平具有良好的抑制作用，對(duì)腫 瘤細(xì)胞株具有良好的抗增殖活性，具有合理的成藥性參數(shù)，如適合的解離常數(shù)（pKa)、脂水 分布系數(shù)（Lo曲，抑=7. 4)、水溶性及膜透過率。藥代動(dòng)力學(xué)的研究表明本發(fā)明化合物在 大鼠體內(nèi)分布較廣，血漿清除率處在可接受的范圍內(nèi)，且具有較好的生物利用度。本發(fā)明化 合物及其藥物制劑可W用于治療由于組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶酶活性失調(diào)而導(dǎo)致的一系列疾病， 例如，實(shí)體瘤，白血病、追疾W及神經(jīng)退行性等疾病。
[0007] 本發(fā)明設(shè)及下列通式（I)的化合物
[0008]
[0009] 其中Ar代表
[0010] W代表C、N、0或S;
[0011] L代表Ci-Ce的碳鏈；
[001引Ri代表面素、徑基、-NRA、硝酸醋基、硫氯基、Ci-Ce烷氧基、C2-Ce不飽和締氧基、Ci-Ce烷基酷氧基或取代的Ce-Cs苯基酷氧基，所述取代基是氨、面素、甲氧基、硝基、徑基或 NRA；
[001引R2代表-NRA、被0-2個(gè)Z取代基取代的苯基、含有1-2個(gè)選自N、0或S的五元、 六元飽和或不飽和雜環(huán)或者含有該不飽和雜環(huán)的苯并雜環(huán)，其中取代基Z基是面素、氨基、 徑基、硝基、氯基、簇基、Ci-Ce的烷基、Ci-Ce的烷氧基或Ci-Ce的烷基胺基；
[0014] Ra、Rb各自獨(dú)立代表H、c1-Ce烷基、C1-Ce徑烷基或C1-Ce燒酷基；或Ra、Rb連接形成 含有1-2個(gè)N或0原子的5-6元雜環(huán)；
[0015] Rs代表單、雙或S取代，取代基為H、面素、C1-C3烷氧基或C1-C3燒硫基。
[001引Ar優(yōu)選代賽
[0017]Ri優(yōu)選代表-NRaRb，其中R。、Rb各自獨(dú)立地代表H、甲基、乙基、丙基、異丙基、正下 基、徑乙基或徑丙基；或者R。、Rb連接形成四氨化咯基、咪挫基、贓晚基、4-氧代贓晚基、嗎啡 嘟基、贓嗦基、N-甲基贓嗦基、N-甲基高贓嗦基、N-乙基贓嗦基，N-丙基贓嗦基、N-異丙基 贓嗦基、N-環(huán)戊基贓嗦基、N-環(huán)己基贓嗦基、N-苯基贓嗦基、N-芐基贓嗦基或N-喀晚基贓 嗦基。
[0018]R2優(yōu)選代表-NRaRb，其中R。、Rb各自獨(dú)立地代表H、甲基、乙基、丙基、異丙基、正下 基、徑乙基或徑丙基；或者R。、Rb連接形成四氨化咯基、咪挫基、贓晚基、4-氧代贓晚基、嗎 啡嘟基、贓嗦基、N-甲基贓嗦基、N-甲基高贓嗦基、N-乙基贓嗦基、N-丙基贓嗦基、N-異丙 基贓嗦基、N-環(huán)戊基贓嗦基、N-環(huán)己基贓嗦基、N-苯基贓嗦基、N-芐基贓嗦基；或2-氣苯 基、3-氣苯基、4-氣苯基，2, 4-二氣苯基、4-甲基苯基、4-甲氧基苯基、4-=氣甲氧基苯基， 2-氯苯基、3-氯苯基、4-氯苯基，2, 4-二氯苯基或3-氣-4-氯苯基。
[0019]R3優(yōu)選代表單、雙或=取代基，取代基選自氨、氯、甲氧基或甲硫基。
[0020] 更優(yōu)選下列任一結(jié)構(gòu)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：
[0021]
[0022] 通式（I)化合物及藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物都包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
[0023] 本發(fā)明化合物（I)可用下列方法制備：
[0024]
[00巧]首先適當(dāng)?shù)纳虡I(yè)購(gòu)買的原料1經(jīng)過漠代得到中間體2,中間體2在AICI3作用下和 商業(yè)購(gòu)買的各種
受生取代反應(yīng)得到中間體3,隨后目標(biāo)化合物由中間體3和商業(yè)網(wǎng) 購(gòu)買的各種Ri發(fā)生取代反應(yīng)得到。
[0026] 通式（I)所述化合物及其中間體可W通過常見的分離方法進(jìn)行純化，如重結(jié)晶、 柱層析等。
[0027] 本發(fā)明還公開了一種藥物組合，通式（I)化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化 物可W添加藥學(xué)上可接受的載體制成常見的藥物制劑，如片劑、膠囊、粉劑、糖漿、液劑、懸 浮劑、針劑，可W加入香料、甜味劑、液體或固體填充料或稀釋劑等常用的藥物輔料。
[0028] 本發(fā)明所述的化合物在臨床上的給藥方式可W采用口服、注射等方式。
[0029] 本發(fā)明的化合物（I)臨床所用劑量為0.0 lmg~lOOOmg/天，也可根據(jù)病情的輕重 或劑型的不同偏離此范圍。
[0030] 下面是本發(fā)明化合物的部分藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)及結(jié)果，藥理部分的化合物代號(hào)所對(duì)應(yīng)的 結(jié)構(gòu)式等同于實(shí)施例部分的代號(hào)所對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)式：
[0031] 一、對(duì)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制實(shí)驗(yàn)
[0032] 材料試劑及儀器：384孔不透明黑板，Biotinylatedhistone冊(cè)peptide、SAM與 組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶；特異性識(shí)別甲基化位點(diǎn)的一抗及相應(yīng)的抗鼠微珠，Streptavidin偶聯(lián) 的微珠，AlphaScreenmicroplatereader酶標(biāo)儀。
[0033] 組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制活性測(cè)定方法：將Biotin^atedhistone冊(cè)趴ptide、 SAM與組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶混合，同時(shí)加入不同濃度的通式（I)化合物，每個(gè)濃度做=個(gè)復(fù) 孔，在室溫下反應(yīng)60分鐘后，加入特異性識(shí)別甲基化位點(diǎn)的一抗及相應(yīng)的抗鼠微珠，混 勻后，室溫解育90分鐘，最后加入Streptavidin偶聯(lián)的微珠，混勻并解育30分鐘后，在 Perki址Imer公司的A1地aScreenmicroplatereader酶標(biāo)儀上檢測(cè)相應(yīng)的TR-FRET信號(hào)。
[0034]數(shù)據(jù)分析方法：a)計(jì)算每個(gè)樣本的平均信號(hào)值；b)每個(gè)樣本濃度的信號(hào)值減去背 景信號(hào)值，C)計(jì)算每個(gè)樣本的抑制率。
[0035] %抑制率=(A藥物-A本底）/ (A對(duì)照-A本底）X100 %
[0036] 用GraphpadPrisms軟件處理，計(jì)算出化合物的ICs。值
[0037] 表1本發(fā)明代表化合物對(duì)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的ICs。
[0038]

[0039] 二、對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外抗增殖實(shí)驗(yàn)
[0040] 測(cè)試本發(fā)明化合物對(duì)人類結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116,人類乳腺癌細(xì)胞株MC巧及人肝 癌細(xì)胞化巧G2)的抗增殖活性。方法：共選用S種腫瘤細(xì)胞（肥T116,MCF7,化pG2)。將細(xì) 胞接種于96孔的平板中（每孔約有4000-10000個(gè)細(xì)胞），24小時(shí)后，將不同濃度的化合物 加入至細(xì)胞中，72小時(shí)后，各小孔中分別加入20yLM1T的PBS溶液（濃度為5mg/mL)，于 37°C解育4小時(shí)，除去MTT，每個(gè)小孔中分別加入150yLDMS0(含量為100% )，于570皿下 檢測(cè)（采用化ermoMultiskanSpectrum)。其中UNC0638是目前報(bào)道的酶活和細(xì)胞活都較 好的小分子抑制劑，被廣泛應(yīng)用為陽(yáng)性對(duì)照。
[0041] 表2本發(fā)明代表化合物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株的抗增殖活性
[0042]
[0043]
[0044]=、在細(xì)胞內(nèi)對(duì)組蛋白底物的甲基化水平影響實(shí)驗(yàn)
[0045] 測(cè)試本發(fā)明化合物在人類乳腺癌細(xì)胞株MCF7中對(duì)組蛋白底物甲基化水平的影 響。方法：蛋白免疫印跡WesternBlot。將細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37°C，％含量 5%的解箱中培養(yǎng)24h后，將不同濃度的化合物加入至細(xì)胞中培養(yǎng)24小時(shí)后，收集細(xì)胞 (2.5*105)，使用細(xì)胞裂解液RIPA進(jìn)行細(xì)胞破碎進(jìn)行蛋白提取，BCA方法測(cè)定蛋白濃度，進(jìn) 行SDS-PAGE凝膠電泳，分別對(duì)目的條帶進(jìn)行一抗4°C過夜解育，TBS緩沖液洗涂，二抗解育， 應(yīng)用OdysseyInfraredImagingSystem進(jìn)行目的蛋白的檢測(cè)。
[0046] 圖1和圖2分別代表化合物CPUY074017和CPUY074020對(duì)冊(cè)腳me2和冊(cè)腳me3甲 基化水平的影響。
[0047] 上述藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：本發(fā)明化合物對(duì)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶表現(xiàn)出顯著的抑制作 用，部分化合物的抑制活性（ICJ處于較低微摩爾水平。運(yùn)對(duì)新型骨架的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移 酶抑制劑的發(fā)現(xiàn)及其作用機(jī)制的研究都有重要意義。
[0048] 本發(fā)明化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞肥T116,MC巧和化pG2細(xì)胞具有較好的抗增殖活性，其 中部分化合物的抗增殖活性甚至高于陽(yáng)性對(duì)照UNC0638。
【附圖說明】
[0049] 圖1是CPUY074017對(duì)冊(cè)腳me2和冊(cè)腳me3甲基化水平的影響
[0050] 圖2是CPUY074020對(duì)冊(cè)腳me2和冊(cè)腳me3甲基化水平的影響
【具體實(shí)施方式】
[00川實(shí)施例1
[005引 3, 5-二漠-6H-蔥[l，9-cd]異惡挫-6-酬的制備
[0053]
[0054] 將6H-蔥[l，9-cd]異惡挫-6-酬巧g，22.eOmmol)溶于AcOH巧0血）中，同時(shí)將 漠化90mL，56. 51mmol)的醋酸溶液滴加至反應(yīng)液中，TLC檢測(cè)，反應(yīng)停止。將該反應(yīng)液 用飽和碳酸氨鋼調(diào)至弱堿性，用二氯甲燒（3X50mL)萃取，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鋼干燥，旋 干溶劑，柱層析分離得到黃色3,5-二漠-6H-蔥[l，9-cd]異惡挫-6-酬（7. 26g，73% ). m.p. 247-248r.巾NMR(300MHz，CDCls) :68. 45 (d，J二 7. 71Hz，IH，ArH)，8. 08 (d，J二 7. 5Hz，IH，Ar田，7. 97 (s，化，ArH)，7. 82 (t，J= 7. 23Hz，IH，ArH)，7. 72 (t，J=7. 3甜z，ArH). HRMS(ESI):calcdforCi4HsBr2N〇2[M+H]+377. 8760,found377. 8752.
[0055] 實(shí)施例2
[0056]
陽(yáng)〇57]將不同取代的氨溶解在溶有無(wú)水氯化鉛的二氯甲燒溶液中，實(shí)施例1化合物加入 到該混合物中，于4(TC攬拌12h，TLC檢測(cè)，停止反應(yīng)。將該反應(yīng)液用水（2X30mL)萃取。有 機(jī)層用無(wú)水硫酸鋼干燥，旋干溶劑得到紅色固體。
[0058] W下化合物（實(shí)施例3-11)均按照上述方法由實(shí)施例2經(jīng)取代反應(yīng)合成。
[00則實(shí)施例3
[0060] 3-漠-5-((4-甲氧基苯基）氨基）-6H-慈[l，9-cd]異惡嗤-6-麗的制備
[0061]
[0062] 3, 5-二漠-6H-蔥[1，9-cd]異惡性-6-麗（0.lOg, 0.26mmol)和對(duì)甲氧基苯 胺（；0. 19g,l.SSmmoU按照實(shí)施例 2 方法合成。m.P. 156-157°C.ifiNMR(300MHz，CDCl3) :6ll. 32(s，lH，NH)，8. 58(d，J= 7. 23Hz，lH，ArH)，8. 18(d，J= 7. 23Hz，ArH)，7.82(t，J = 7.47Hz，lH，ArH)，7.70(t，J= 8.01^，lH，ArH)，7.62(s，lH，A^)，7.30(d，J= 8. 79Hz，2H，Arii)，7. 05 (d,J=8. 85Hz，2H，ArH)，3. 91 (s，地，甜3).HRMS(ESU:calcdforC2 iHi3BrN2〇3[M+H]+421. 0182,found421. 0186.
[0063]實(shí)施例4
[0064] 3-漠-5-((4-甲基苯基）氨基）-6H-蔥[l，9-cd]異惡挫-6-酬的制備
[00 的]
[^066]本品由3, 5-二漠-6H-蔥[l，9-cd]異惡嗤-6-酬（0.lOg,0.26mm〇l)和對(duì)甲基苯 胺（0. 17g, 1. 58mmol)按照實(shí)施例 2 方法合成。m.P. 197-198°C.屯NMR(300MHz，CDCI3) : 5 11. ：35 (S，1H，畑），8. 54 (d，J= 7. 68Hz，1H,ArH)，8. 14 (d，J= 7.化化，1H，Aril)，7. 79 (t，J= 7. ：35Hz，IH，ArH)，7. 67 (t，J= 5. 79Hz，2H，ArH)，7. 32 (d，J二8. 19Hz，2H，ArH)，7. 25 (d，J= 8. lOHz，2H，ArH)，2. 43 (s，3H，紐3).HRMS(ESI) :calcdforC2化3BrN2〇2[M+H] +405. 0233,foun d405. 0229.
[0067] 實(shí)施例5
[0068] 4-((3-漠-6-氧一6護(hù)蔥[1，9-(：(1]異惡挫-5-基）氨基）苯甲臘
[0069]
[0070] 本品由3, 5-二漠-6H-蔥[l，9-cd]異惡挫-6-酬〇).lOg, 0. 26mmol)和對(duì)氯基苯 胺 〇). 18g, 1. 58mmol)按照實(shí)施例 2 方法合成。m.P. 179-180°C.電NMR(300MHz，CDCI3) : 5 11.45(s, 1H,畑），8.55 (d，J= 7.47Hz,IH'ArH),8. 19 (d，J= 7.47Hz, 1H,ArH), 7. 88-7. 81 ( m, 4H,ArH)，7. 74 (d,J=8. 37Hz,IH,ArH)，7. 49 (d,J=8. 55Hz, 2H,ArH).HRMS(ESI) :calcd forC21H10化N3O2DM+田+416. 0027，found416. 0031.
[00川實(shí)施例6
[007引 3-漠-5-((4-氯苯基）氨基）-6H-蔥[l，9-cd]異惡挫-6-酬的制備
[0073]
[0074]本品由 3, 5-二漠-6H-蔥[l，9-cd]異惡挫-6-酬 〇).lOg, 0. 26mmol)和對(duì)氯苯 胺（0. 20g, 1. 58mmol)按照實(shí)施例 2 方法合成。m.P. 189-190°C.咱NMR(300MHz，CDCI3) : 5 11. 33(S,1H,畑），8. 56 (d,J= 7. 23Hz,