交換蛋白及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種植物耐逆性化+化0/H+交換蛋白及其編碼基 因與應(yīng)用，特別涉及一種與植物耐鹽和耐低鐘性相關(guān)的大豆化+化+)/H+交換蛋白GmNcl1及 其編碼基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] ±壤中高濃度的鹽分對(duì)作物造成滲透脅迫和離子毒害，鹽分脅迫影響著植物產(chǎn) 量、蛋白質(zhì)合成和光合作用W及能量代謝，從而影響作物的生長(zhǎng)，嚴(yán)重導(dǎo)致作物減產(chǎn)。全世 界至少有20%耕地鹽潰化，我國(guó)各種鹽潰±壤資源總面積約達(dá)9913萬(wàn)公頃，大部分位于大 豆主產(chǎn)區(qū)。±壤次生鹽堿化日趨嚴(yán)重，次生鹽堿地的面積逐漸增加。因此，提高農(nóng)作物的耐 鹽能力，對(duì)于擴(kuò)大可耕地面積，增加和穩(wěn)定作物產(chǎn)量，具有重要的意義。大豆是一種中度耐 鹽的作物，解析大豆耐鹽脅迫反應(yīng)的機(jī)制，不僅對(duì)于植物生物學(xué)本身的理論研究意義重大， 而且對(duì)于耐鹽育種及提高大豆抗脅迫能力的轉(zhuǎn)基因策略具有重要的指導(dǎo)意義。
[0003] 離子脅迫和滲透脅迫是高鹽毒害的兩個(gè)主要方面，維持細(xì)胞內(nèi)無(wú)機(jī)離子的平衡對(duì) 于提高植物的耐鹽能力有著很重要的作用，無(wú)機(jī)離子也是植物細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)的重要物質(zhì)， 能維持細(xì)胞的滲透壓。造成植物鹽害的主要離子是化+，而r是重要的滲透調(diào)節(jié)組分，在鹽 堿±地或含鹽量較高的±壤中生長(zhǎng)的作物往往承受著雙毒害作用：化+的毒害和r的虧缺。 植物對(duì)鹽脅迫形成一系列生理機(jī)制，主要包括化+的外排、化+的區(qū)隔化和限制化+向葉片運(yùn) 輸?shù)龋托C(jī)制都需要化+〇〇 /H+交換蛋白的參與。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種與植物耐逆性相關(guān)的蛋白質(zhì)及其編碼基因與應(yīng)用。
[000引本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)，名稱為GmNcll，來(lái)源于大豆（Glycinemax(L. )Me;r;r.)品 種鐵豐8號(hào)，是如下（a)或化）：
[0006] (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0007] 化）將（a)所限定的蛋白質(zhì)的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加，且與植物耐逆性相關(guān)的蛋白質(zhì)。
[000引為了便于GmNcll蛋白的純化，可在由序列表中序列1的氨基酸殘基序列組成的蛋 白質(zhì)的氨基末端或駿基末端連接上如下表所示的標(biāo)簽。
[000引表；柄;簽的序列
[0010]

[0011]
[0012] 上述化）中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。 上述化）中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾 個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變。
[0013] 編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0014] 所述核酸分子可W是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA;所述核酸分子也可W 是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
[0015] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述核酸分子具體為編碼所述GmNcll蛋白的基因（命 名為GmNcll);所述GmNcll基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子：
[001引 1)編碼序列為序列表中序列2所示的DNA分子；
[0017] 2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子；
[001引 3)與1)或2)限定的DNA分子具有90%W上同源性且編碼所述GmNcll蛋白的DNA分子。
[0019] 上述嚴(yán)格條件可為用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0. 1 %SDS和 1XSSC，0. 1 %SDS各洗膜一次。
[0020] 其中，序列2由2520個(gè)核巧酸組成，第1-2520位為0RF，編碼序列表中序列1所示 的GmNcll蛋白。
[0021] 含有上述核酸分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
[0022] 所述重組載體可為重組表達(dá)載體，也可為重組克隆載體。
[0023] 所述重組表達(dá)載體可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建。所述植物表達(dá)載體包括雙元 農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如pGreen0029、PCAMBIA3301、PCAMBIA1300、 PBI121、地inl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表達(dá)載體。所述植物表達(dá) 載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺巧酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加 工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺巧酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺巧酸加入到mRNA前體的3'端。使 用所述基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核巧酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、 組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如花挪菜花葉病毒（CAMV)35S啟動(dòng)子、泛素基因化iquitin 啟動(dòng)子（P化i)、脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子rd29A等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合 使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或 轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，送些增強(qiáng)子區(qū)域可W是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與 編碼序列的閱讀框相同，W保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的 來(lái)源是廣泛的，可W是天然的，也可W是合成的。翻譯起始區(qū)域可W來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié) 構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用重組表達(dá)載體進(jìn)行 加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性 的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。也可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接w逆境 篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0024] 在本發(fā)明中，所述重組表達(dá)載體中啟動(dòng)所述GmNcll基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子具體為35S 啟動(dòng)子。
[0025] 更為具體的，所述重組表達(dá)載體為如下（I)或（II):
[0026] (I)在地1121載體的酶切位點(diǎn)中插入所述GmNcll基因得到的重組質(zhì)粒。所述酶 切位點(diǎn)具體為甜aI和化0I。
[0027] (II)在PCAMBIA3300載體的酶切位點(diǎn)中插入所述GmNcll基因得到的重組質(zhì)粒。 所述酶切位點(diǎn)具體為甜aI和BamHI。
[002引所述表達(dá)盒由能夠啟動(dòng)所述GmNcll基因表達(dá)的啟動(dòng)子，所述GmNcll基因，W及轉(zhuǎn) 錄終止序列組成。
[0029] 所述GmNcll蛋白，或所述核酸分子，或所述重組表達(dá)載體、表達(dá)盒或重組菌在如 下任一中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0030](a1)調(diào)控植物的耐逆性；
[0031](曰2)選育耐逆性增強(qiáng)的植物品種。
[0032] 在本發(fā)明中，所述調(diào)控植物的耐逆性具體體現(xiàn)在；在所述植物體內(nèi)，若所述 GmNcll基因的表達(dá)量越高，則所述植物的耐逆性越強(qiáng)。
[0033] 在本發(fā)明中，所述選育耐逆性增強(qiáng)的植物品種的方法，具體可包括將所述GmNcll 基因表達(dá)量較高的植株作為親本進(jìn)行雜交的步驟。
[0034] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育耐逆性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0035] 本發(fā)明所提供的培育耐逆性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物的方法，具體可包括如下步驟：
[0036]a)向目的植物中導(dǎo)入所述GmNcll蛋白的編碼基因，得到表達(dá)所述編碼基因的轉(zhuǎn) 基因植物；
[0037]b)從步驟a)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到與所述目的植物相比，耐逆性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因 植物。
[0038] 所述GmNcll蛋白在所述轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)量高于所述目的植物；編碼所述 GmNcll蛋白的基因（即GmNcll基因）是所述基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子：
[0039] 1)編碼序列為序列表中序列2所示的DNA分子；
[0040] 2)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA分子雜交且編碼所述GmNcll蛋白的DNA 分子；
[00川 3)與1)或2)限定的DNA分子具有90%W上同源性且編碼所述GmNcll蛋白的 DNA分子。
[0042] 上述嚴(yán)格條件可為用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0. 1 %SDS和 1XSSC，0. 1 %SDS各洗膜一次。
[0043] 所述GmNcll基因具體可通過(guò)上述任一所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中， 也可通過(guò)最小化線性轉(zhuǎn)化元件（如；WpCAMBIA3300-GmNcll載體為模板通過(guò)巢式PCR方 法擴(kuò)增得到包括T-DNA右邊界序列+35S啟動(dòng)子+序列2+N0S終止子+T-DNA左邊界序列的 DNA片段）導(dǎo)入所述目的植物中，得到所述轉(zhuǎn)基因植物。具體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、化質(zhì)粒、 植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法將所 述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。
[0044] 在上述應(yīng)用或方法中，所述耐逆性為如下中的至少一種；耐鹽性、耐低鐘。
[0045]進(jìn)一步，所述鹽可為 100-200mM化C1，如 100-125mM化C1、125-175mM化C1 或