可激活酵母菌和植物細(xì)胞基因表達(dá)的多肽片段及驗(yàn)證方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種可激活酵母菌和植物細(xì)胞基因表達(dá) 的多膚片段及驗(yàn)證方法。
【背景技術(shù)】
[0002]AtDPBF4/E化基因編碼了一個(gè)堿性亮氨酸拉鏈類化-n巧轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)產(chǎn)物 在擬南芥種子胚胎發(fā)育晚期基因表達(dá)調(diào)控，種子萌發(fā)W及脫落酸（ABA)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著 重要的調(diào)控作用。與其它典型的轉(zhuǎn)錄因子一樣，AtDPBF4/E化也含有重要的兩個(gè)功能域： DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域值抓）和轉(zhuǎn)錄激活域（TAD)，前者與基因啟動(dòng)子區(qū)的上游激活序列0JA巧結(jié) 合，后者與一種稱為介導(dǎo)因子（Mediator)的蛋白質(zhì)復(fù)合物中的某些區(qū)域結(jié)合，介導(dǎo)因子還 可同時(shí)與RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄機(jī)器相互作用，運(yùn)些蛋白質(zhì)-DNA，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用就 激活或抑制了祀基因的表達(dá)，從而在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)的開啟或關(guān)閉。
[0003]W往的研究結(jié)果表明，AtDPBF4/E化中負(fù)責(zé)與DNA結(jié)合的區(qū)域就是簇基端的位于 堿性亮氨酸拉鏈區(qū)下游的某些氨基酸殘基，而負(fù)責(zé)激活轉(zhuǎn)錄的功能域的研究尚處于探索階 段。有研究報(bào)道稱，轉(zhuǎn)錄因子化f2與GAL4D抓融合表達(dá)至酵母菌細(xì)胞時(shí)，只表現(xiàn)出微弱地 轉(zhuǎn)錄激活活性，而將化f2的第113至251位氨基酸殘基與GAL4D抓融合表達(dá)至酵母菌細(xì) 胞時(shí)，則表現(xiàn)出很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活活性；研究人員在對(duì)FHL3缺失突變分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，其LIM4結(jié) 構(gòu)域中的第二個(gè)鋒指結(jié)構(gòu)單獨(dú)與GAL4D抓融合表達(dá)至酵母菌細(xì)胞時(shí)，可激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn) 錄。到目前為止，國(guó)內(nèi)外尚未見AtDPBF4/E化中能激活基因表達(dá)的多膚片段的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種可激活酵母菌和植物細(xì)胞基因表達(dá)的多膚片段及驗(yàn) 證方法，旨在更加深入地解析特定轉(zhuǎn)錄因子激活相關(guān)生物性狀基因表達(dá)、培育具期望生物 性狀的植物/作物的分子途徑。 陽(yáng)〇化]本發(fā)明是運(yùn)樣實(shí)現(xiàn)的，一種可激活酵母菌和植物細(xì)胞基因表達(dá)的多膚片段，其特 征在于，包括AD1多膚片段和AD2多膚片段，其中，所述AD1多膚片段如SEQ IDN0:1所示 (GKPLGSMNL呢LLKTVLPPAE巧；所述AD2多膚片段如沈QIDN0:2所示（NIASNGQWVEYH冊(cè)PQQ QQGFMTYPVCEMQDMVMMGGLSDTPQAP)〇
[0006] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述可激活酵母菌和植物細(xì)胞基因表達(dá)的多膚片段的驗(yàn)證 方法，包括W下步驟：
[0007] (1)利用PCR技術(shù)體外擴(kuò)增AtDPBF4/E化基因（Gene10:818706)形成一系列缺失 突變體，擴(kuò)增的缺失突變體分別連接至酵母菌表達(dá)載體PGBKT7,分別將空載的PGBKT7質(zhì)粒 和上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌Y187菌株，對(duì)各個(gè)突變體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄激活活性分析；
[0008] (2)根據(jù)在酵母菌系統(tǒng)中的AtDPBF4/E化缺失突變分析的結(jié)果，合成3'末端相互 覆蓋的DNA片段，通過鏈延伸合成出完整的AD1的編碼區(qū)序列，延伸產(chǎn)物連接至擬南芥葉肉 原生質(zhì)體瞬間表達(dá)分析效應(yīng)載體pH犯ff，將重組質(zhì)粒命名為抑犯ff-ADl ;通過PCR技術(shù)體 外擴(kuò)增出完整的AD2的編碼區(qū)序列，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接至擬南芥葉肉原生質(zhì)體瞬間表達(dá)分析 效應(yīng)載體抑犯ff，將重組質(zhì)粒命名為抑犯ff-AD2 ;
[0009] (3)WpH犯ff作為陰性對(duì)照，P冊(cè)Rep-6作為報(bào)告基因載體，利用上述重組質(zhì)粒 pH犯ff-ADl、重組質(zhì)粒抑犯ff-AD2進(jìn)行擬南芥葉肉原生質(zhì)體瞬間表達(dá)分析，驗(yàn)證AD1多膚 片段和AD2多膚片段在植物細(xì)胞中具有激活轉(zhuǎn)錄的活性。
[0010] 優(yōu)選地，在步驟（1)中，所述缺失突變體包括D1至D11缺失突變體；所述重組 質(zhì)粒分別命名為PGBKT7-D1、PGBKT7-D2、PGBKT7-D3、PGBKT7-D4、PGBKT7-D5、PGBKT7-D6、 PGBKT7-D7、PGBKT7-D8、PGBKT7-D9、PGBKT7-D10、PGBKT7-D11 ;其中，
[0011] 所述PCR技術(shù)體外擴(kuò)增AtDPBFV邸L的缺失突變體基因D1所用引物為： 陽(yáng)01 引 D1 上游引物：5，-CGGAATTCCACTTAGGAAGTTCTGGAAAACCAC-3，
[0013] D1 下游引物：5，-CGGGATCCAGGCGCTTGTGGTGTATCCGATAATC-3，
[0014] 所述PCR技術(shù)擴(kuò)增D2所用引物為： 陽(yáng)〇1引 D2上游引物：
[0016] 5' -CGGAATTCCTTGTTCGTCAGGGAAGCTTGACGTTAC-3，
[0017] D2 下游引物：5, -CGGGATCCAGGCGCTTGTGGTGTATCCGATAATC-3，
[0018] 所述PCR技術(shù)擴(kuò)增D3所用引物為：
[0019] D3 上游引物：5, -CGGAATTCACTACTACTACTCATAAGCAGCCTAC-3，
[0020] D3 下游引物：5，-CGGGATCCAGGCGCTTGTGGTGTATCCGATAATC-3 '
[0021] 所述PCR技術(shù)擴(kuò)增D4所用引物為：
[0022] D4 上游引物：5 ' -CGGAATTCTTGTTGAGAGCTGGTGTAGTGACTGAG-3 '
[0023]D4 下游引物：5，-CGGGATCCAGGCGCTTGTGGTGTATCCGATAATC-3，
[0024] 所述PCR技術(shù)擴(kuò)增D5所用引物為： 陽(yáng)0巧]D5上游引物：
[0026] 5 ^ -CGGAATTCAACATAGCTTCAAATGGGCAATGGGTTG-3 ^
[0027] D5 下游引物：5，-CGGGATCCAGGCGCTTGTGGTGTATCCGATAATC-3，
[0028] 所述PCR技術(shù)擴(kuò)增D6所用引物為：
[0029] D6 上游引物：5 ' -CGGAATTCATGGGTTCTATTAGAGGAAACATTG-3，
[0030]D6 下游引物：5，-CGGGATCCAGGCGCTTGTGGTGTATCCGATAATC-3 '
[0031] 所述PCR技術(shù)擴(kuò)增D7所用引物為：
[0032]D7 上游引物：5 ' -CGGAATTCATGGGTTCTATTAGAGGAAACATTG-3，
[0033]D7 下游引物：5 ' -CGGGATCCAACAACATTTTCTTGAGGGACTACTG-3，
[0034] 所述PCR技術(shù)擴(kuò)增D8所用引物為：
[0035]D8 上游引物：5 ' -CGGAATTCATGGGTTCTATTAGAGGAAACATTG-3，
[0036]D8 下游引物：5 ' -CGGGATCCTCTCCAGACCTCATCAACAGTC-3，
[0037] 所述PCR技術(shù)擴(kuò)增D9所用引物為：
[0038]D9 上游引物：5，-CGGAATTCATGGGTTCTATTAGAGGAAACATTG-3，
[0039]D9 下游引物：5 ' -CGGGATCCTCGAGGTAACGTCAAGCTTCCCTGAC-3，
[0040] 所述PCR技術(shù)擴(kuò)增D10所用引物為：
[0041] D10 上游引物：5, -CGGAATTCATGGGTTCTATTAGAGGAAACATTG-3，
[0042] DIO下游引物：5, -CGGGATCCTTCCTCAGCTGGTGGCAAGACAGTC-3' W43] 所述PCR技術(shù)擴(kuò)增Dll所用引物為：
[0044] D11 上游引物：5 ' -CGGAATTCATGGGTTCTATTAGAGGAAACATTG-3，
[0045] D11 下游引物：5，-CGGGATCCAGAACTTCCTAAGTGGGATTGAAC-3，。
[0046] 優(yōu)選地，在步驟（2)中，所述鏈延伸合成完整的AD1的編碼區(qū)序列所用DNA序列 為：
[0047] AD1正義鏈序列：
[0048] 5, -CTGAATTCGGAAAACCACTAGGAAGCATGAACCTTGATGAGCTTC TC-3， W例 AD1反義鏈序列： 陽(yáng)0加]5>-CTGGATCCTTATTCCTCAGCTGGTGGCAAGACAGTCTTGAGAAGCTCATC-3'
[0051] 所述PCR技術(shù)擴(kuò)增完整的AD2的編碼區(qū)序列所用引物為： 陽(yáng)05引 AD2上游引物：
[0053] 5' -CTGAATTCAACATAGCT TCAAATGGGCAATG-3'
[0054] AD2下游引物： 陽(yáng)化5] 5' -CTGGATCCTTMGGCGCTTGTGGTGTATCCGATAATC-3'
[0056] 本發(fā)明提供了一種基于轉(zhuǎn)錄因子AtDPBFV邸L的可激活酵母菌和植物細(xì)胞基因 表達(dá)的兩個(gè)多膚片段，在本發(fā)明中，通過在酵母菌單雜交系統(tǒng)中對(duì)AtDPBF4/E化進(jìn)行雙向 缺失突變分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，AtDPBF4/E化中存在兩個(gè)能激活基因表達(dá)的片段，即位于AtDPBFV E化氨基端保守的第38~59位的膚段（AD1)和位于AtDPBFV邸L中部區(qū)域非保守的第 132~176位膚段（AD2);將體外合成出AD1和AD2的編碼區(qū)序列并分別連接至擬南芥葉肉 原生質(zhì)體瞬間表達(dá)分析效應(yīng)載體pH犯ff，重組質(zhì)粒命名為抑犯ff-ADl和抑犯ff-AD2,同時(shí) WpH犯ff作為陰性對(duì)照，WP冊(cè)Rep-6為報(bào)告基因載體，進(jìn)行擬南芥葉肉原生質(zhì)體瞬間表達(dá) 分析，結(jié)果表明運(yùn)兩個(gè)片段（ADUAD2)在植物細(xì)胞中也具有激活報(bào)告基因（GU巧轉(zhuǎn)錄的活 性，即轉(zhuǎn)錄激活活性。
[0057] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了AtDPBF4/E化中2個(gè)全新的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，為進(jìn)一步構(gòu)建抗干旱、耐鹽 堿轉(zhuǎn)基因植物提供了基礎(chǔ)，同時(shí)有助于更深入地了解抗逆性基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理，對(duì) 基因工程作物的培育和改良具有重要的指導(dǎo)意義。
【附圖說明】
[0058] 圖1是在酵母菌單雜交系統(tǒng)中AtDPBF4/E化缺失突變分析結(jié)果；其中，control: 空載質(zhì)粒PGBKT7 ;D1 :AtDPBF4/E化中第33-176位氨基酸殘基；D2 :AtDPBF4/邸L中第 61-176位氨基酸殘基；D3 :AtDPBF4/E化中第96-176位氨基酸殘基；D4 :AtDPBF4/E化中第 114-176位氨基酸殘基；D5 :AtDPBF4/E化中第132-176位氨基酸殘基；D6 :AtDPBF4/E化中 第1-176位氨基酸殘基；D7 :AtDPBF4/E化中第1-131位氨基酸殘基；D8 :AtDPBF4/E化中 第1-84位氨基酸殘基；D9 :AtDPBF4/邸L中第1-71位氨基酸殘基；D10 :AtDPBF4/E化中第 1-59位氨基酸殘基；D11 :AtDPBF4/E化中第1-37位氨基酸殘基。
[0059] 圖2是重組質(zhì)粒抑犯ff-ADl和抑犯ff-AD2經(jīng)PCR鑒定后的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果； 其中，M:DNA分子量標(biāo)志；1 重組質(zhì)粒抑犯ff-ADl為模板，用一對(duì)通用引物擴(kuò)增出的PCR 產(chǎn)物；2 重組質(zhì)粒抑犯ff-AD2為模板，用一對(duì)通用引物擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物；3 空載質(zhì) 粒抑犯ff為模板，