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      鄰苯二甲酸二甲酯人工免疫原及其制備和用圖

      文檔序號:9446723閱讀:469來源:國知局
      鄰苯二甲酸二甲酯人工免疫原及其制備和用圖
      【技術領域】
      [0001] 本發(fā)明設及一種鄰苯二甲酸二甲醋人工免疫原DMP-BSA及其制備和用途,具體是 一種用于新興持久性有機污染物一一塑化劑類免疫檢測的鄰苯二甲酸二甲醋人工免疫原 DMP-BSA及其制備方法和用途。
      【背景技術】
      [0002] 鄰苯二甲酸醋類塑化劑(縮寫為PAEs),又稱獻酸醋類,是一類由鄰苯二甲酸與含 有4-15個碳的醇發(fā)生費歇爾(Fischer)醋化反應所形成的醋的重要衍生物的統(tǒng)稱。運類物 質有特殊性氣味,毒性較大,一般情況下狀態(tài)為粘稠液體;液態(tài)條件下溫度范圍寬,流動性 大,揮發(fā)性低,不溶于水,易溶于大多數(shù)有機溶劑。運類物質用途廣泛,它不僅可作為食品包 裝材料、玩具、農藥載體、驅蟲劑、潤滑劑、乙締地板和壁紙、去泡劑、清潔劑、醫(yī)用材料(如 人工屯、臟瓣膜等人工器官、血袋、注射器和膠管)和個人護理用品(主要有化妝品、香味品、 指甲油、頭發(fā)噴霧劑、香皂和洗發(fā)液)等近千種產品的生產原材料,還常作為塑料增塑劑被 用于改造塑料制品性能。
      [0003] 鄰苯二甲酸二甲醋(英文名稱:Dimethyl地thalate,簡稱DMP),又名獻酸二甲 醋、避蚊醋、驅蚊油等,CAS號為131-11-3,分子式為。訊1。〇4,分子量為194. 19,無色透明微 黃色油狀液體,稍具芳香味,能與乙醇、乙酸等一般有機溶劑混溶,不溶于水和石油酸;高度 易燃,遇明火、高熱、氧化劑有燃燒的危險。該物質微毒,對眼睛粘膜有較強的刺激性;可能 對胎兒造成傷害,對水生生物有極高毒性;有損害生育能力的危險性;吸入、皮膚接觸及吞 食有毒;人體組織內可蓄積,從而抑制中樞神經系統(tǒng)。由于其具備良好的塑膜性、粘著性和 防水性,故常被用于制作醋酸纖維素的薄膜、清漆涂料、透明紙和成模塑料粉等;還可用作 驅蚊油、聚氣乙締涂料W及殺蟲劑的溶劑3。近些年來,由于頻頻發(fā)現(xiàn)該物質在食品、水體中 的含量過高,因此,該物質含量的檢測便備受關注。
      [0004] 目前,關于鄰苯二甲酸二甲醋的研究主要集中在水體、沉積物、大氣等環(huán)境領域和 生物體的毒性方面,但樣品的檢測方法方面研究較少。目前對鄰苯二甲酸二甲醋的檢測手 段主要為氣相色譜和高效液相色譜等儀器檢測方法,運些方法雖然準確可靠,但對樣品的 預處理方法和操作人員的專業(yè)性有很高的要求。正因為運些方法的處理復雜、耗時、儀器價 格昂貴而不適合推廣使用,也不利于在環(huán)境污染事故現(xiàn)場快速檢測。為克服運些缺點,尋求 一種快速、簡便、靈敏且經濟實用的分析方法就成為環(huán)境監(jiān)測領域的主要研究方向。
      [0005] 20世紀60年代發(fā)展起來的免疫分析(Immunoassay,IA)是基于抗原和抗體的特異 性、可逆性結合反應的分析技術。免疫分析具有常規(guī)理化分析技術無可比擬的選擇性和高 靈敏性,非常適合復雜介質中痕量組分的分析。因此免疫分析具有的特異性強、靈敏度高、 方法快捷簡單、分析通量大、檢測成本低等優(yōu)點,使得該類方法可W滿足簡單、快速、靈敏地 檢測持久性有機污染物的要求。1985年美國Cetus公司的K.B.Mullis和R.K.Saiki等發(fā) 明了一種特異性DNA體外擴增技術,成為化lymerase化ainReaction,簡稱PCR,即聚合酶 鏈式反應。1992年Sano等將免疫分析技術與PCR技術結合,發(fā)展出巧光免疫PCR技術。巧 光免疫PCR技術兼具了免疫分析的特異性強和PCR技術的靈敏度高(檢測限高達10 11~ 10i2g/L)的特點,可用于檢測環(huán)境中痕量污染物。
      [0006] 目前,尚無用巧光免疫PCR技術檢測DMP的相關報道。而制備合格的DMP人工免 疫原是生物免疫得到高特異性抗DMP抗體的前提,更是建立DMP巧光免疫PCR檢測分析方 法的關鍵,運將具有重要的應用價值和理論研究意義。

      【發(fā)明內容】

      [0007] 針對上述現(xiàn)有技術中的缺陷,本發(fā)明的目的是提供一種步驟簡單,速度快,產率高 的鄰苯二甲酸二甲醋人工免疫原值MP-BSA)及其制備和用途,為免疫得到特異性抗體和利 用人工抗原、抗體建立免疫檢測方法奠定基礎。
      [0008] 本發(fā)明的目的是通過W下技術方案實現(xiàn)的:
      [0009] 第一方面,本發(fā)明設及一種鄰苯二甲酸二甲醋的人工免疫原DMP-BSA,其結構式如 式(I)所示:
      [0010]
      BSA為牛血清蛋白。
      [0011] 第二方面,本發(fā)明設及一種鄰苯二甲酸二甲醋的人工免疫原DMP-BSA的制備方 法,所述方法包括采用重氮化法將DMP半抗房
      與牛血清蛋白 BSA偶聯(lián)制備人工免疫原DMP-BSA。
      [0012] 優(yōu)選的,所述方法具體包括如下步驟:
      [0013] S1、將所述DMP半抗原溶于呈強酸性的水溶液中,形成DMP半抗原溶液;
      [0014] S2、向所述DMP半抗原溶液中滴加(逐滴加入,就是一滴一滴的滴入,每滴之間 沒有間隔;加入速度過快容易導致重氮鹽制備效率降低)亞硝酸鋼溶液(1M),控制抑為 2. 0~3. 0,反應(20~40min,優(yōu)選30min)結束后去除未反應的亞硝酸鋼,生成重氮鹽溶 液;
      [0015]S3、將牛血清蛋白BSA溶于0.01~0.05MpH9. 18 (抑過高或過低,均不利于本發(fā) 明人工免疫原的制備)棚酸鋼緩沖液中,形成牛血清蛋白溶液;
      [0016]S4、在所述重氮鹽溶液中滴加所述牛血清蛋白溶液,發(fā)生偶聯(lián)反應,即得所述人工 免疫原DMP-BSA。
      [0017] 本發(fā)明采用重氮化法合成鄰苯二甲酸二甲醋人工免疫原,其反應方程式如下:
      [0018]
      [0019] 上述反應方程式中,中間產物重氮鹽與牛血清蛋白BSA結合,偶聯(lián)脫氯,生成了 DMP人工免疫頂
      [0020] 優(yōu)選的,所述DMP半抗原、強酸、亞硝酸鋼、牛血清蛋白BSA的摩爾比為1:3~ 4:8 ~10:0. 001 ~0. 005。
      [0021] 優(yōu)選的,步驟S1中,所述強酸性的水溶液中的強酸選自濃鹽酸、濃硫酸或濃硝酸。
      [0022] 優(yōu)選的,步驟S1中,所述去除未反應的亞硝酸鋼是加入尿素W去除未反應的亞硝 酸鋼,所述尿素與DMP半抗原的摩爾比為300~350:1。
      [0023] 優(yōu)選的,步驟S4中,所述偶聯(lián)反應是在0~4°C、攬拌的條件下進行,所述攬拌時間 為2~3小時。所有需要保持蛋白活性的長時間反應都需要在低溫情況下進行,經驗表明 0~4°C最合適。此外,為充分反應,根據經驗,當半抗原與強酸、亞硝酸鋼、尿素、BSA的摩 爾比為1:3:8:300:0.001時攬拌反應2小時就可W,當半抗原與強酸、亞硝酸鋼、尿素、BSA 的摩爾比為1:4:10:350:0. 005時反應就需要3小時。
      [0024] 優(yōu)選的,所述步驟S4還包括偶聯(lián)反應結束后,離屯、分離,將上清液裝入透析袋中 透析,離屯、分離沉淀即得所述人工免疫原DMP-BSA的步驟。
      [0025] 優(yōu)選的,所述DMP半抗原是由包括如下步驟的方法制備而得:
      [00%] 4-硝基鄰苯二甲酵
      與甲醇在濃鹽酸或濃硫酸的催化下 回流反應,生成4-硝基鄰苯二甲酸二甲醋;
      [0027] W苯或甲苯為溶劑,所述4-硝基鄰苯二甲酸二甲醋和鋒粉、濃鹽酸或濃硫酸發(fā)生 還原反應,生成所述DMP半抗原。DMP半抗原化學名稱為4-氨基鄰苯二甲酸二甲醋,分子式 為CwHiiNO"分子量 209. 20。 陽02引所述4-硝基鄰苯二甲酸、甲醇、濃鹽酸或濃硫酸的摩爾比為1:5~6. 5:0. 6~ 0. 7 ;所述4-硝基鄰苯二甲酸二甲醋、濃鹽酸或濃硫酸、苯或甲苯和鋒粉的摩爾比為1:20~ 22:550~570:20~22。(其中苯或甲苯作為基質溶液并不參與反應)
      [0029] 理想狀態(tài)下,4-硝基鄰苯二甲酸、甲醇的摩爾比是1:2,但為了反應順利進行,一 般甲醇的用量是4-硝基鄰苯二甲酸的摩爾量的5倍W上,但不能超過4-硝基鄰苯二甲酸 的摩爾量的6. 5倍;此外,強酸作為醋化反應的催化劑,所用量一般是原料4-硝基鄰苯二甲 酸摩爾量的0. 5倍W上,但不超過原料4-硝基鄰苯二甲酸摩爾量的0. 7倍;甲醇在80°C處 于沸騰狀態(tài),那么l〇〇°C更處于沸騰狀態(tài),反應向右進行。
      [0030] 所述回流反應的溫度為80~100°C,反應時間為5~6小時。
      [0031] 所述還原反應的溫度為25~28°C,反應時間為12~15小時。
      [0032] 4-硝基鄰苯二甲酸二甲醋的制備中,還包括回流反應結束后蒸饋除去未反應的 甲醇和生成的水;此時將液體趁熱倒入冰水中,析出固體;過濾后得到的固體粗品用10% NazCOs溶液洗涂至水層呈無色,固體粗品用無水乙醇重結晶,得到純化后的4-硝基鄰苯二 甲酸二甲醋的步驟。
      [003引 DMP半抗原的制備中,還包括還原反應結束后用冰水和強堿溶
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