鄰苯二甲酸二甲酯人工包被原制備及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于小分子有機(jī)污染物的免疫化學(xué)及生物分析技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及有機(jī)合成、 免疫化學(xué)、分子生物學(xué)、理化檢測(cè)等技術(shù)，具體設(shè)及一種鄰苯二甲酸二甲醋人工包被原的制 備方法及用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 鄰苯二甲酸醋類塑化劑（縮寫為PAEs)，又稱獻(xiàn)酸醋類，是一類由鄰苯二甲酸與含 有4-15個(gè)碳的醇發(fā)生費(fèi)歇爾（Fischer)醋化反應(yīng)所形成的醋的重要衍生物的統(tǒng)稱。運(yùn)類物 質(zhì)有特殊性氣味，毒性較大，一般情況下狀態(tài)為粘稠液體；液態(tài)條件下溫度范圍寬，流動(dòng)性 大，揮發(fā)性低，不溶于水，易溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑。運(yùn)類物質(zhì)用途廣泛，它不僅可作為食品包 裝材料、玩具、農(nóng)藥載體、驅(qū)蟲劑、潤(rùn)滑劑、乙締地板和壁紙、去泡劑、清潔劑、醫(yī)用材料（如 人工屯、臟瓣膜等人工器官、血袋、注射器和膠管）和個(gè)人護(hù)理用品（主要有化妝品、香味品、 指甲油、頭發(fā)噴霧劑、香皂和洗發(fā)液）等近千種產(chǎn)品的生產(chǎn)原材料，還常作為塑料增塑劑被 用于改造塑料制品性能。
[0003] 鄰苯二甲酸二甲醋（英文名稱：Dimethyl地thalate，簡(jiǎn)稱DMP)，又名獻(xiàn)酸二甲 醋、避蚊醋、驅(qū)蚊油等，CAS號(hào)為131-11-3,分子式為。訊1。〇4,分子量為194. 19,無色透明微 黃色油狀液體，稍具芳香味，能與乙醇、乙酸等一般有機(jī)溶劑混溶，不溶于水和石油酸；高度 易燃，遇明火、高熱、氧化劑有燃燒的危險(xiǎn)。該物質(zhì)微毒，對(duì)眼睛粘膜有較強(qiáng)的刺激性；可能 對(duì)胎兒造成傷害，對(duì)水生生物有極高毒性；有損害生育能力的危險(xiǎn)性；吸入、皮膚接觸及吞 食有毒；人體組織內(nèi)可蓄積，從而抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)。由于其具備良好的塑膜性、粘著性和 防水性，故常被用于制作醋酸纖維素的薄膜、清漆涂料、透明紙和成模塑料粉等；還可用作 驅(qū)蚊油、聚氣乙締涂料W及殺蟲劑的溶劑3。近些年來，由于頻頻發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)在食品、水體中 的含量過高，因此，該物質(zhì)含量的檢測(cè)便備受關(guān)注。
[0004] 目前，關(guān)于DMP的研究主要集中在水體、沉積物、大氣等環(huán)境領(lǐng)域和生物體的毒性 方面，但樣品的檢測(cè)方法方面研究較少。目前對(duì)鄰苯二甲酸二甲醋的檢測(cè)手段主要為氣相 色譜和高效液相色譜等儀器檢測(cè)方法，運(yùn)些方法雖然準(zhǔn)確可靠，但對(duì)樣品的預(yù)處理方法和 操作人員的專業(yè)性有很高的要求。正因?yàn)檫\(yùn)些方法的處理復(fù)雜、耗時(shí)、儀器價(jià)格昂貴而不適 合推廣使用，也不利于在環(huán)境污染事故現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。為克服運(yùn)些缺點(diǎn)，尋求一種快速、簡(jiǎn) 便、靈敏且經(jīng)濟(jì)實(shí)用的分析方法就成為環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的主要研究方向。因此，開展研究并建 立有效、可靠的塑化劑的檢測(cè)方法及標(biāo)準(zhǔn)，并通過相關(guān)的法規(guī)予W保障，成為一項(xiàng)極為重要 和迫切的工作。
[0005] 0世紀(jì)60年代發(fā)展起來的免疫分析（Immunoassay,IA)是基于抗原和抗體的特異 性、可逆性結(jié)合反應(yīng)的分析技術(shù)。免疫分析具有常規(guī)理化分析技術(shù)無可比擬的選擇性和高 靈敏性，非常適合復(fù)雜介質(zhì)中痕量組分的分析。因此免疫分析具有的特異性強(qiáng)、靈敏度高、 方法快捷簡(jiǎn)單、分析通量大、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)，使得該類方法可W滿足簡(jiǎn)單、快速、靈敏地 檢測(cè)持久性有機(jī)污染物的要求。1985年美國(guó)Cetus公司的K.B.Mullis和R.K.Saiki等發(fā) 明了一種特異性DNA體外擴(kuò)增技術(shù)，成為化lymerase化ainReaction,簡(jiǎn)稱PCR，即聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。1992年Sano等將免疫分析技術(shù)與PCR技術(shù)結(jié)合，發(fā)展出巧光免疫PCR技術(shù)。巧 光免疫PCR技術(shù)兼具了免疫分析的特異性強(qiáng)和PCR技術(shù)的靈敏度高（檢測(cè)限高達(dá)10 11~ 10i2g/L)的特點(diǎn)，可用于檢測(cè)環(huán)境中痕量污染物。
[0006] 目前，尚無用巧光免疫PCR技術(shù)檢測(cè)鄰苯二甲酸二甲醋的相關(guān)報(bào)道。而制備合格 的鄰苯二甲酸二甲醋人工包被原是建立鄰苯二甲酸二甲醋生物免疫分析檢測(cè)方法的關(guān)鍵， 更是建立DMP免疫檢測(cè)分析方法的關(guān)鍵，運(yùn)將具有重要的應(yīng)用價(jià)值和理論研究意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種步驟簡(jiǎn)單，速度快，產(chǎn) 率高的鄰苯二甲酸二甲醋人工包被原值MP-0VA)及其制備和用途；本發(fā)明制備的塑化劑鄰 苯二甲酸二甲醋人工包被原值MP-0VA)為利用包被原、高特異性的多克隆抗體建立巧光免 疫PCR檢測(cè)分析方法奠定基礎(chǔ)。該巧光免疫PCR檢測(cè)分析方法克服了現(xiàn)有檢測(cè)方法的缺 點(diǎn)：樣品預(yù)處理復(fù)雜費(fèi)時(shí)，檢測(cè)儀器昂貴，操作人員操作要求高，方法不易于推廣，不能用于 環(huán)境污染事故的批量現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等。
[0008] 本發(fā)明的目的是通過W下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：
[0009] 第一方面，本發(fā)明設(shè)及一種鄰苯二甲酸二甲醋人工包被原，其結(jié)構(gòu)式如下：
[0010]
[0011] 第二方面，本發(fā)明設(shè)及一種鄰苯二甲酸二甲醋人工包被原的制備方法，所述方法 包括：
[0012] 采用戊二醒法，將鄰苯二甲酸二甲醋半抗原
與卵清 白蛋白（OVA)偶聯(lián)反應(yīng)，即得所述鄰苯二甲酸二甲醋人工包被原值MP-0VA)。
[0013] 優(yōu)選的，所述偶聯(lián)反應(yīng)是在0~4°C冰浴遮光條件下進(jìn)行的，反應(yīng)時(shí)間為24~ 30h。所述偶聯(lián)反應(yīng)是在非質(zhì)子性有機(jī)溶劑存在的條件下進(jìn)行的，所述非質(zhì)子性有機(jī)溶劑選 自N，N-二甲基甲酯胺或二甲亞諷。
[0014] 優(yōu)選的，所述方法還包括離屯、分離，透析上清液，再次離屯、分離得到所述鄰苯二甲 酸二甲醋人工包被原的步驟。
[0015] 優(yōu)選的，所述鄰苯二甲酸二甲醋半抗原、戊二醒和卵清白蛋白的摩爾比為1:3~ 5:0. 005 ~0. 01。
[0016] 優(yōu)選的，所述方法包括將所述鄰苯二甲酸二甲醋半抗原溶解于非質(zhì)子性有機(jī)溶劑 中形成半抗原溶液的步驟；所述非質(zhì)子性有機(jī)溶劑選自N，N-二甲基甲酯胺或二甲亞諷。
[0017] 優(yōu)選的，所述鄰苯二甲酸二甲醋半抗原是通過包括如下步驟的方法制備而得的：
[001引 S1、在強(qiáng)酸性介質(zhì)存在的條件下，4-硝基鄰苯二甲酸
與 甲醇發(fā)生醋化反應(yīng)，生成4-硝基鄰苯二甲酸二甲醋；
[0019] S2、在非質(zhì)子性有機(jī)溶劑存在的條件下，所述4-硝基鄰苯二甲酸二甲醋和鋒粉在 強(qiáng)酸的作用下發(fā)生還原反應(yīng)，生成鄰苯二甲酸二甲醋半抗原，即DMP半抗原，化學(xué)名稱為 4-氨基鄰苯二甲酸二甲醋，分子式Ci〇HiiN〇4,分子量209. 20。
[0020] 優(yōu)選的，步驟S1中，4-硝基鄰苯二甲酸、甲醇、強(qiáng)酸性介質(zhì)的摩爾比為1:5~ 6. 5:0. 5~0. 7 ;所述醋化反應(yīng)的溫度為80~100°C，醋化反應(yīng)時(shí)間為5~6小時(shí)；所述強(qiáng) 酸性介質(zhì)選自濃鹽酸、濃硫酸或濃硝酸。
[0021] 優(yōu)選的，步驟S2中，所述4-硝基鄰苯二甲酸二甲醋與強(qiáng)酸、非質(zhì)子性有機(jī)溶劑和 鋒粉的摩爾比為1:20~22:550~570:20~22 (其中非質(zhì)子性有機(jī)溶劑作為基質(zhì)溶液并 不參與反應(yīng)）；所述還原反應(yīng)的溫度為25~28°C，還原反應(yīng)時(shí)間為12~15小時(shí)。所述非 質(zhì)子性有機(jī)溶劑選自苯或甲苯。所述強(qiáng)酸選自濃鹽酸、濃硫酸或濃硝酸
[0022] 優(yōu)選的，步驟S1還包括醋化反應(yīng)結(jié)束后蒸饋除去未反應(yīng)的甲醇和生成的水，再趁 熱將液體倒入冰水中，析出的固體粗品用10%NazCOs溶液洗涂至水層呈無色，重結(jié)晶，得到 純化后的4-硝基鄰苯二甲酸二甲醋的步驟。
[0023] 優(yōu)選的，步驟S2還包括還原反應(yīng)結(jié)束后用冰水和強(qiáng)堿W終止反應(yīng)，苯萃取反應(yīng) 液，分離、干燥并減壓蒸饋去除有機(jī)相，得到的粗品再用硅膠柱層析（洗脫劑為體積比為 1:8的乙酸和正己燒的混合液）純化，得到純化后的鄰苯二甲酸二甲醋半抗原的步驟。有機(jī) 相W除去苯，后減壓蒸饋，
[0024] 優(yōu)選地，所述采用戊二醒法將鄰苯二甲酸二甲醋半抗原與蛋白質(zhì)分子卵清白蛋白 OVA偶聯(lián)制備人工包被原DMP-0VA具體包括W下步驟：
[00巧]B、將DMP半抗原溶于非質(zhì)子溶劑中，形成DMP半抗原溶液；卵清白蛋白OVA溶于PBS中，形成卵清白蛋白溶液；將所述DMP半抗原溶液滴入卵清白蛋白OVA溶液中形成反應(yīng) 液；
[0026] C、向上述反應(yīng)液中加入戊二醒，攬拌反應(yīng)；
[0027] D、反應(yīng)結(jié)束后，離屯、分離上清液，將上清液裝入透析袋中透析，離屯、分離沉淀后得 即得鄰苯二甲酸二甲醋人工包被原DMP-0VA。
[0028] 本發(fā)明采用戊二醒法合成鄰苯二甲酸二甲醋人工包被原，其反應(yīng)方程式如下：
[0029]
[0030] 上述反應(yīng)方程式中，戊二醒一端的醒基與鄰苯二甲酸二甲醋半抗原4-氨基鄰苯 二甲酸二甲醋的氨基結(jié)合，戊二醒另一端的醒基與卵清白蛋白OVA-端的氨基結(jié)合，偶聯(lián) 脫水，生成了DMP人工包被原
[0031]
[0032] 優(yōu)選地，所述DMP半抗原、戊二醒、OVA的摩爾比為1:3~5:0. 005~0. 01。 陽(yáng)03引優(yōu)選地，步驟C中，所述攬拌時(shí)間為24~30小時(shí)。
[0034] 為充分反應(yīng)，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，當(dāng)半抗原與戊二醒、OVA反應(yīng)的摩爾比是1:5:0. 005時(shí)攬 拌反應(yīng)24小時(shí)就可W，當(dāng)半抗原與戊二醒、OVA反應(yīng)的摩爾比是1:3:0. 01時(shí)反應(yīng)就需要30 小時(shí)。 陽(yáng)03引優(yōu)選地，步驟B中，所述非質(zhì)子溶劑為N，N-二甲基甲酯胺或二甲亞諷；所述將DMP半抗原溶液滴入OVA溶液是在0~4°C低溫磁力攬拌下進(jìn)行。所有需要保持蛋白活性的