一種用于畜禽養(yǎng)殖的凝結(jié)芽孢桿菌制劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及畜禽養(yǎng)殖添加劑領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種用于畜禽養(yǎng)殖的微生物制劑-凝 結(jié)芽抱桿菌及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著養(yǎng)殖業(yè)集約化、規(guī)?；难该桶l(fā)展，養(yǎng)殖動(dòng)物病害爆發(fā)越來越頻繁， 危害也越來越大，養(yǎng)殖動(dòng)物病害已經(jīng)成為限制養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸。
[0003] 抗生素等化學(xué)藥劑在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用已有幾十年的歷史，對(duì)預(yù)防動(dòng)物疾病，提高 養(yǎng)殖業(yè)的產(chǎn)量和質(zhì)量起到了積極的作用。但隨著認(rèn)識(shí)的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期使用抗生 素會(huì)破壞畜禽消化道內(nèi)的微生物區(qū)系，使動(dòng)物機(jī)體對(duì)抗生素產(chǎn)生抗藥性，W及抗生素在畜 禽產(chǎn)品中的殘留等，已經(jīng)直接影響到人類的健康和生態(tài)環(huán)境的安全。因此尋找能夠克服上 述弊端的抗生素替代物，開發(fā)新型安全的綠色飼料添加劑，已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注和研究 的熱點(diǎn)。
[0004] 微生態(tài)添加劑是一種采用營(yíng)養(yǎng)緩釋技術(shù)、生物發(fā)酵技術(shù)和特殊生產(chǎn)工藝培養(yǎng)而成 的一種多功能微生物制劑，它既不會(huì)產(chǎn)生抗藥性，又無藥物殘留等問題，被認(rèn)為是取代抗生 素最具潛力的飼料添加劑，得到了越來越多的重視。目前乳酸菌、芽抱桿菌是應(yīng)用最為廣泛 的微生態(tài)制劑。乳酸菌能為宿主提供可利用的必需氨基酸和各種維生素，有直接促進(jìn)生長(zhǎng) 的作用。芽抱桿菌能產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶、可溶性淀粉酶等活性物質(zhì)，還能分泌抗菌素，在動(dòng) 物腸道內(nèi)具有較強(qiáng)生物奪氧能力，對(duì)促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)乳酸菌、雙歧桿菌等有益厭氧微生物的 生長(zhǎng)，維持微生態(tài)平衡起到重要作用。因此，集中兩者優(yōu)點(diǎn)的產(chǎn)乳酸芽抱桿菌的研究在近年 來成為了益生菌菌株研發(fā)的熱點(diǎn)。在發(fā)達(dá)國(guó)家已得到較多應(yīng)用的凝結(jié)芽抱桿菌是飼用產(chǎn)乳 酸芽抱桿菌中最重要的一種，它不僅具有乳酸菌的所有特點(diǎn)，由于能產(chǎn)生芽抱，它還具有芽 抱桿菌所有的獨(dú)特性，是當(dāng)前較好的動(dòng)物保健品種之一。早在1989年，美國(guó)FDA就公布了 41種可用于飼料的安全菌株，1992年再次批準(zhǔn)42種，其中凝結(jié)芽抱桿菌排在第一位。我國(guó) 對(duì)凝結(jié)芽抱桿菌的研究開發(fā)起步較晚，近年來國(guó)內(nèi)對(duì)凝結(jié)芽抱桿菌的研究多集中在醫(yī)學(xué)方 面，并已取得了很好的療效。用于治療腸道菌群素亂引起的腸炎、腹瀉、便秘、消化不良等， 效果顯著。因此，開發(fā)出功能強(qiáng)，成本低、針對(duì)性強(qiáng)的畜禽養(yǎng)殖用微生態(tài)制劑已成為國(guó)內(nèi)外 研究的重點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽(yáng)〇化]本發(fā)明目的在于，利用從自然環(huán)境中篩選的高效菌種，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法和現(xiàn)代生 物發(fā)酵工程技術(shù)與手段，進(jìn)行低成本、高密度產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和先進(jìn)的后處理加工工藝，作為抗 生素的替代物應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)，對(duì)促進(jìn)畜牧業(yè)增產(chǎn)、增效及健康持續(xù)發(fā)展，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效 益和開發(fā)前景。本發(fā)明的另一目的是提供一種該微生物制劑的制備方法。
[0006] 本發(fā)明目的通過W下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。
[0007] 一種用于畜禽養(yǎng)殖的凝結(jié)芽抱桿菌制劑，其中，該制劑包括保藏在在中國(guó)武漢， 中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、保藏，保藏編號(hào)為CCTCCNo:M2011422的BFS-2菌株。
[0008]種凝結(jié)芽抱桿菌度acilluscoagulans)BFS-2菌株：
[0009]我們從斷奶仔豬腸道、菜園±壤、泡菜等不同來源中分離具有較高產(chǎn)酸能力的微 生物菌株，并結(jié)合細(xì)菌的形態(tài)特征、生理生化指標(biāo)，16SrRNA分子鑒定等方式對(duì)獲得的高效 菌株進(jìn)行鑒定；并在此基礎(chǔ)上，對(duì)獲得的凝結(jié)芽抱桿菌的抑菌活性進(jìn)行初步分析。結(jié)果表 明，從上述各種不同來源中總共分離得到產(chǎn)酸菌株43株，在經(jīng)過產(chǎn)酸試驗(yàn)和耐酸、耐膽鹽 試驗(yàn)初步篩選后，確定了3株微生物菌株。經(jīng)過后續(xù)生理生化和分子鑒定，運(yùn)3株均為凝結(jié) 芽抱桿菌。抑菌結(jié)果表明，運(yùn)3株凝結(jié)芽抱桿菌對(duì)芽抱類桿菌的抑制效果較差，對(duì)大腸桿菌 等腸道條件致病菌的抑制情況較好，其中綜合效果最好的菌株為BFS-2,該菌株取樣分離自 浙江杭州的一個(gè)菜園。
[0010] 保藏菌株的形態(tài)、培養(yǎng)、生理、生化等特征：
[0011] 凝結(jié)芽抱桿菌BFS-2菌株：屬芽抱桿菌度acilluscoagulans);革蘭氏陽(yáng)性菌，在MRS液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，細(xì)胞桿狀，有芽抱；在MRS瓊脂平板上培養(yǎng)時(shí)菌落圓形，邊緣整 齊，規(guī)則，灰白色，表面有光澤。 陽(yáng)01引該BFS-2菌株已于2011年11月25日，在中國(guó)武漢，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、保 藏，保藏編號(hào)：CCTCCNo:M2011422。
[0013] 另一方面，本發(fā)明提供一種制備用于畜禽養(yǎng)殖的微生物制劑-凝結(jié)芽抱桿菌制 劑，
[0014] 該制劑可按W下方法獲得：W馬鈴馨葡萄糖固體培養(yǎng)基為斜面培養(yǎng)基；W馬鈴馨 葡萄糖液體培養(yǎng)基為搖瓶菌種培養(yǎng)基；按重量可溶性淀粉2-5 %，酵母膏0. 5-1 %，蛋白 腺0. 5-1. 5%，豆巧1. 0-1. 5%，水補(bǔ)足至100%配制成種子罐和發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基；W保 藏編號(hào)為CCTCCNo:M2011422的凝結(jié)芽抱桿菌度acilluscoagulans)BFS-2菌株為菌種， 經(jīng)各級(jí)發(fā)酵后制備而成活菌數(shù)為lXl〇SCRJ/g的凝結(jié)芽抱桿菌。
[0015]用于畜禽養(yǎng)殖微生物制劑-凝結(jié)芽抱桿菌制劑的制備方法，按W下步驟進(jìn)行：
[0016] (1)各級(jí)培養(yǎng)基的配制，其中：
[0017]a)斜面培養(yǎng)基：馬鈴馨葡萄糖固體培養(yǎng)基，備用；
[0018] b)搖瓶菌種培養(yǎng)基：馬鈴馨葡萄糖液體培養(yǎng)基，備用；
[0019]C)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基：按重量可溶性淀粉2-5%，酵母膏0.5-1%，蛋白腺0.5-1. 5%，豆巧 1. 0-1. 5%，水補(bǔ)足至 100% ;
[0020]d)發(fā)酵罐培養(yǎng)基：按重量可溶性淀粉2-5%，酵母膏0.5-1 %，蛋白腺0.5-1. 5%，豆巧 1. 0-1. 5%，水補(bǔ)足至 100%; 陽(yáng)02U 似斜面菌種的培養(yǎng)：將保藏菌種：CGMCCNo. 2288凝結(jié)芽抱桿菌BFS-2菌株接種 于步驟（1)斜面培養(yǎng)基上，在28-37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時(shí)，取出后直接應(yīng)用或放 入冰箱中冷藏，備用；
[00巧 做搖瓶菌種擴(kuò)增：在無菌操作下，取一環(huán)斜面菌種接入60ml步驟（1)搖瓶菌種 培養(yǎng)基中，于28-37°C，110-220轉(zhuǎn)/分的搖床中，培養(yǎng)18-24小時(shí)，取出直接應(yīng)用或放 入冰箱中冷藏，備用；
[002引 （4)種子罐發(fā)酵：將步驟（1)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基放入種子罐中，在種子罐內(nèi)溫度 12rC保持30分鐘后，保壓至0.IMPa，進(jìn)行蒸汽高溫滅菌后冷卻至28-37°C;在火焰保護(hù) 下迅速通過接種閥口向種子罐內(nèi)接入步驟（3)搖瓶菌種，接種量為5-10%;開動(dòng)攬拌機(jī)在 轉(zhuǎn)速110-220轉(zhuǎn)/分，溫度28-37°C，通氣量4mVh，罐壓0. 02-0. 06MPa，pH自然，培養(yǎng) 18-24小時(shí)，備用；
[0024] (5)批量產(chǎn)品的制備：將步驟（1)發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基放入發(fā)酵罐中，在發(fā)酵罐內(nèi)溫 度12rC，保壓至0.IMPa，保持30分鐘后把培養(yǎng)基冷卻至28-37°C;通過移種管道向發(fā)酵罐 內(nèi)接入步驟（4)種子罐菌種，接種量為5-10%;開動(dòng)攬拌機(jī)在轉(zhuǎn)速110-220轉(zhuǎn)/分，溫度 28-37°C，通氣量20mVh，罐壓0. 02-0. 06MPa，抑自然，培養(yǎng)18-24小時(shí)，取樣檢驗(yàn)，根 據(jù)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行后處理（產(chǎn)品形態(tài)根據(jù)客戶需要生產(chǎn)成固體或者液體），灌裝，封口， 即成用于畜禽養(yǎng)殖的微生物制劑，其中，凝結(jié)芽抱活菌數(shù)為lXl〇SCRJ/g。
[00巧]畜禽養(yǎng)殖微生物制劑-凝結(jié)芽抱桿菌的應(yīng)用方法：每噸飼料中按質(zhì)量百分比為 0. 005-0. 1 %的用量添加微生物制劑-凝結(jié)芽抱桿菌，攬拌均勻后直接飼喂，其中，該制劑 包括保藏在在中國(guó)武漢，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、保藏，保藏編號(hào)為CCTCCNo:M2011422 的BFS-2菌株或該菌株的培養(yǎng)產(chǎn)物。運(yùn)里的濃度可W為0. 005 %，0. 05 %，0. 1 %中的任何比 值。
[00%] 在一些優(yōu)選的方式中，凝結(jié)芽抱桿菌的質(zhì)量百分比為0. 05%。
[0027] 在一些優(yōu)選的方式中，凝結(jié)芽抱活菌數(shù)為lX108-5X108CFU/g。
[0028] 對(duì)于保藏細(xì)菌的生物學(xué)特性說