防治黃瓜綠斑駁花葉病毒病的生防菌株hw17及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物領域，設及防治黃瓜綠斑駁花葉病毒病的生防菌株冊17 及其應用。
【背景技術】
[0002] 黃瓜綠斑駁花葉病毒（化州mbergreenmottlemosaicvirus,CGMMV)是世界 上許多國家和地區(qū)葫蘆科植物上的重要檢疫性病毒，嚴重威脅著西瓜、甜瓜、黃瓜等作物生 產(chǎn)。1935年，英國Ainsworth首次報道了CGMMV在黃瓜上的為害，此后被傳到歐洲、亞洲、 南美洲的20多個國家。2005年我國迂寧蓋州地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)該病害，因其為害嚴重，2006年 12月21日，農(nóng)業(yè)部發(fā)布788號公告，將CGMMV確定為全國農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物。
[0003] 黃瓜綠斑駁花葉病毒的自然寄主主要為葫蘆科植物，如黃瓜、西瓜、甜瓜、西葫蘆、 絲瓜等，也可侵染寬色襲、曼佗羅、煙草、括樓等植物。作物一旦被黃瓜綠斑駁花葉病毒危 害，損失非常嚴重，一般會造成產(chǎn)量損失15%~30%，嚴重的會達到60%W上，甚至絕收。 培育抗病品種盡管是最快速有效的方法，但是由于其遺傳機理及背景的復雜性，很難培育 出抗性穩(wěn)定的品種，同時由于抗病品種價格較貴，一般農(nóng)民沒有購買能力，因此限制了抗病 品種的推廣應用。另一方面，黃瓜綠斑駁花葉病毒病主要是W種子傳播和接觸傳染為傳播 途徑，病毒可通過寄主微小傷口進入組織內(nèi)部，也可通過嫁接操作使健康植株感染病毒，病 毒可在±壤中越冬，且活性可保持1年W上，成為下一年侵染源，從而難W防控。因此，利用 植株自身抗性是綜合防控黃瓜綠斑駁花葉病毒病的關鍵途徑，在運方面，利用穎頑菌誘導 植株產(chǎn)生對CGMMV的抗性是很有前景的發(fā)展方向。
[0004] 穎頑菌是一類具有防病促生作用的有益微生物，它們可W從植物多個生境中分離 得至Ij。已有大量研究報道了將穎頑菌引入植物可提高植物的抗病、抗蟲、抗逆性。由于穎頑 菌在抑制植物病害方面的廣譜性、高效性W及安全性，目前成為農(nóng)藥市場發(fā)展的趨勢，被稱 為是最有潛力的發(fā)展方向。因此，開發(fā)新的、更為高效和安全的微生物制劑控制黃瓜綠斑駁 花葉病毒病的發(fā)生是提高社會生產(chǎn)總量的需要，同時更是農(nóng)業(yè)安全及可持續(xù)發(fā)展的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽〇化]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中沒有對黃瓜綠斑駁花葉病毒病有較高防效的芽 抱桿菌生防制劑的現(xiàn)狀，提供一種防治黃瓜綠斑駁花葉病毒病的單一生防菌菌株及其菌 劑。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供該菌株的應用。
[0007] 本發(fā)明的目的可通過如下技術方案實現(xiàn)：
[0008] 一種防治黃瓜綠斑駁花葉病毒病生防菌株HW17,經(jīng)鑒定該菌株屬于枯草芽抱桿菌 屬度acillussubtilis)，2015年6月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中屯、，菌種保藏號為CGMCCNO. 11025。
[0009] 生防菌株冊17用于制備生防菌劑的方法為：將枯草芽抱桿菌的種子菌液W1:500 體積比接種至LB發(fā)酵培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)，28~30°C、200巧m培養(yǎng)40~48h，然后5000~ 6000巧m離屯、10~15min，用滅菌水進行稀釋制成菌劑，菌劑成品中活菌總濃度為IX109~ lXl〇i°CFU/血。
[0010] 當然，利用所述的防治黃瓜綠斑駁花葉病毒病生防菌株HW17制備生防菌劑并不 限于W上方法。凡是能夠大量培養(yǎng)冊17,且保持其抗黃瓜綠斑駁花葉病毒活性的方法均可 用于制備本發(fā)明請求保護的生防菌劑。
[0011] 所述的保藏號為CGMCCNO. 11025的枯草芽抱桿菌冊17種子菌液制備方法為：將 保藏號為CGMCCNO. 11025的枯草芽抱桿菌HW17菌株接種到LB培養(yǎng)液中28°C培養(yǎng)18化pm 振蕩培養(yǎng)至600nm處的0D值為0. 8時結束培養(yǎng)。 陽01引所述的保藏號為CGMCCNO. 11025的生防菌株冊17在制備防治黃瓜綠斑駁花葉病 毒病的制劑中的應用。
[0013] 所述的生防菌劑稀釋100倍后在黃瓜移栽時進行灌根和噴霧處理，15天為一個間 隔周期共處理2次，發(fā)病時開始統(tǒng)計病情?？莶菅勘U菌HW17對黃瓜綠斑駁花葉病毒病的 防效為49. 63~53. 76%。
[0014] 有益效果：
[0015] 本發(fā)明是?？卺槍S瓜綠斑駁花葉病毒病開發(fā)的生防制劑。由于是生物制劑，完 全沒有因化學農(nóng)藥的使用所帶來的一系列問題，因而有利于蔬菜的無公害生產(chǎn)，農(nóng)民可W 不用或減少其他化學農(nóng)藥的用量，運不僅可為農(nóng)民節(jié)省開支，而且減少化學藥劑的殘留，有 利于蔬菜的出口。
[0016] 溫室實驗表明：該枯草芽抱桿菌屬冊17(CGMCCNO. 11025)能顯著降低黃瓜綠斑 駁花葉病毒病的發(fā)生。利用該菌制備的生防菌劑稀釋100倍在移栽時進行灌根和噴霧處 理，在溫室條件下對黃瓜綠斑駁花葉病毒病的生防效果可W達53. 76%。該菌劑對黃瓜有很 好的促生效果，生物量增加可達87. 54%，并顯著增加黃瓜葉片葉綠素含量。
[0017] 生物樣品保藏信息
[0018] 一種枯草芽抱桿菌屬冊17,分類命名為枯草芽抱桿菌Bacillussubtilis，于 2015年6月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、（CGMCC),保藏 地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，菌種保藏號為CGMCC NO. 11025。
【具體實施方式】
[0019] 實施例1
[0020] 篩選方法：枯草芽抱桿菌屬HW17(CGMCCNO. 1102W由江蘇省淮安市下集鎮(zhèn)西瓜 大棚內(nèi)的健康西瓜根圍分離到。將西瓜根組織切成1cm的小片，用1%的次氯酸鋼浸泡 5min，70%酒精浸泡l-2min，無菌水清洗3次（取最后一次清洗的溶液100y1涂于RzA固 體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，若4化后無菌生長則認為表面消毒干凈，無菌）。取3g消毒好的樣品置 于菌研鉢中，加入27ml無菌的0. 85%化C1，浸軟組織，研磨，用無菌的0. 85%化C1梯度稀 釋。取1〇1、102、103;個梯度的稀釋液各10〇4 1涂于1?24上，28°(：培養(yǎng)4811。挑取最大的 單菌落接種到新鮮RzA固體培養(yǎng)基，經(jīng)反復轉接得到純化菌株。將純化后的菌株用40%甘 油保存于-70°C超低溫冰箱中。
[0021] 篩選方法：
[0022] 為了更好的篩選所分離的菌株，本文對分離菌株的水解酶及嗜鐵素的生產(chǎn)潛力進 行了評估。蛋白酶活性是根據(jù)Yang等的方法進行測定，幾下質(zhì)酶活性是在W膠體狀幾下 質(zhì)為唯一碳源的培養(yǎng)基上測定，P-1，3-葡聚糖酶和纖維素酶活性分別在葡聚糖培養(yǎng)基上 (P-1，3-葡聚糖0.Ig，TSB0. 4g，瓊脂1. 6g，4g/L的剛果紅1血，定容至100血）和纖維素 酶培養(yǎng)基上進行測定，參照化in等人的方法，測定嗜鐵素是否產(chǎn)生。接菌3(TC培養(yǎng)3天觀 察并且測量透明圈內(nèi)徑和外徑。
[0023] 1.1蛋白酶活性測定
[0024] 病毒由蛋白和核酸構成，因此蛋白酶可能會分解蛋白質(zhì)，破壞病毒結果。
[0025] 牙簽挑取處于生長旺盛期的菌株點于蛋白培養(yǎng)基（A:脫脂奶粉8g，溶于300血水 中，121°C滅菌lOmin巧：瓊脂8g，定容至300mL，12rC滅菌20min，A與B分別滅菌后混合） 接菌后30°C培養(yǎng)3天觀察透明圈有無，分別記錄透明圈的內(nèi)徑和外徑。
[0026] 1. 2幾下質(zhì)酶活性測定
[0027] 幾下質(zhì)酶與較多真菌和細菌病害的防治具有一定關系，因此可能也與病毒病的 防治有關。
[00測將分離細菌在W膠體狀幾下質(zhì)為唯一碳源的培養(yǎng)基（Chi-Ayers): (畑4肥P041. 0g，KC10. 2g，MgS04. 7肥0 0. 2g，膠體狀幾下質(zhì) 1% (w/v)定容至 1000血，pH= 7. 0,瓊脂20g)上培養(yǎng)，接菌后30°C培養(yǎng)3天，測透明圈的內(nèi)徑和外徑。
[0029] 膠體狀幾下質(zhì)的制備：20g甲殼素溶于350mL濃鹽酸，4°C放置2地，玻璃棉過濾，濾 液加入化冰無水乙醇（一20°C過夜），lOOOOg離屯、20min，沉淀用自來水沖洗，直至抑為 中性，冷凍干燥，一20°C密封保存。使用時，膠體狀幾下質(zhì)必須用手動勻漿器至少研磨5次 (Roberts and Selitrennikoff, 1988)。
[0030] 1. 3P-1，3-葡聚糖酶活性的檢測
[0031]P-1，3-葡聚糖酶可能會降解真菌的細胞壁，與一些真菌病害防治有關，
[0032] 在葡聚糖平板上（P-1，3-葡聚糖0.Ig，TSB0. 4g，瓊脂1. 6g，4g/L的剛果紅1血， 定容至lOOmL)接菌后30°C培養(yǎng)48h，觀察并測量其透明圈的內(nèi)徑和外徑。
[0033] 1. 4纖維素酶活性的檢測
[0034] 纖維素酶可能會降解真菌的細胞壁，與一些真菌病害防治有關，
[00