. 5倍體積的無水乙醇，移液器混勻。
[0050] (4)轉(zhuǎn)移裂解液至吸附柱中，1300化pm離屯、1分鐘，將過濾柱轉(zhuǎn)移至一個新的收集 管中。
[0051] (5)向過濾柱中加入650y1Washbuffer, 13000巧m離屯、1分鐘，棄廢液。
[00閲 （6)重復(fù)洗一次，棄廢液。
[005引 （7)將過濾柱放入收集管中1300化pm離屯、2分鐘W去除殘留的乙醇。
[0054] (8)過濾柱放入新的收集管中，向過濾柱中加入30-50y1DEPC水，室溫靜置3分 鐘。
[00巧](9) 13000巧m離屯、1分鐘，洗脫DNA。
[0056] (10)野生型痘苗病毒基因組DNA和VACV-0VA基因組DNA放置于-20°C備用。
[0057] 1.2引物設(shè)計與合成
[0058] 根據(jù)野生型痘苗病毒W(wǎng)R株的基因組DNA序列設(shè)計并合成如下兩對引物：
[0059] 擴增A4化上游同源臂的引物對：
[0060]A47化-F1 :5'-CCCAAGCTTTGATTCCATAGGCAGTCCAG-3，（下劃線之前部分為保護 堿基，下劃線部分為Hindlll酶切位點識別序列，其后序列為GenBank:AY243312. 1的第 152935-152954位，即序列1的第1-20位）
[0061]A47化-R1 :5' -AACTGCAGATAAGGTGATTGGAATGGG-3'(下劃線之前部分為保護 堿基，下劃線部分為PstI酶切位點識別序列，其后序列為GenBank:AY243312. 1的第 153921-153939位的反向互補序列，即序列1的第987-1005位的反向互補序列）；
[0062] 擴增A4化下游同源臂的引物對：
[0063] A4化R-F1 :5' -TCCCCCCGGGGATGGACAGTCTATTTTCCTTAG-3'(下劃線之前部分為 保護堿基，下劃線部分為Xmal酶切位點識別序列，其后序列為GenBank:AY243312. 1的第 154628-154650位，即序列2的第1-23位）
[0064]A4化R-R1 :5' -TATGGCGCCTATTGATGCGAGTTCGGTATG-3'(下劃線之前部分為保 護堿基，下劃線部分為KasI酶切位點識別序列，其后序列為GenBank:AY243312. 1的第 155497-155517位的反向互補序列，即序列2的第870-890位的反向互補序列）。
[0065] 根據(jù)OVA基因序列設(shè)計并合成引物：
[0066] 0VA-F1 :5' -CATGCCATGGATGGGCTCCATCGGCGCAG-3' (下劃線之前部分為保護堿基， 下劃線部分為化〇1酶切位點識別序列，其后為序列3的第1-19位）
[0067] 0VA-F2 :5'-TCCCCCCGGGTTAAGGGGAAACACATCTGC-3'（下劃線之前部分為保護堿 基，下劃線部分為Xmal酶切位點識別序列，其后為序列3的第1161-1180位的反向互補序 列）。
[0068] 1. 3穿梭質(zhì)粒pSCllA47k0VA的構(gòu)建及鑒定
[0069] (1)W步驟1. 1中野生型痘苗病毒基因組DNA為模板，W步驟1. 2中合成的A4化 上下游同源臂引物對分別進行PCR，獲得帶有相應(yīng)酶切位點的A4化的上下游同源臂A4化L 和A4化R，W步驟1中VACV-0VA基因組DNA為模板，W步驟2中合成的OVA引物對進行PCR， 獲得帶有相應(yīng)酶切位點的OVA基因片段。
[0070]PCR擴增體系如下：DNAlyl，dNTPmix(2. 5mM)5yl，正向引物F(10yM)lyl，反 向引物R(10yM) 1y1，10Xhqbuffer5y1，Taq酶 1y1，加DEPC水至總體積 50y1。[007。 PCR擴增條件如下：95°C預(yù)變性5min;95°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸80s， 循環(huán)30次；72°C延伸5min，最后置于4°C。
[0072] PCR擴增結(jié)果：PCR產(chǎn)物上樣電泳，A47化為 1022bp，A47LR為 909bp，OVA為 1200bp， 切膠回收目的條帶。
[007引 似首先用限制性內(nèi)切酶化ndlll和PstI對上游同源臂A47化進行雙酶化與經(jīng) 同樣雙酶切的pSCll質(zhì)粒的大片段進行連接，得到中間質(zhì)粒pSCll-A，接著用限制性內(nèi)切酶Xmal和KasI對下游同源臂A47LR進行雙酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的中間質(zhì)粒pSCll-A的大片 段進行連接，得到中間質(zhì)粒PSC11A47L最后用限制性內(nèi)切酶化01和Xmal對OVA基因片段 進行雙酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的中間質(zhì)粒PSC11A47L的大片段進行連接，獲得重組質(zhì)粒，酶 切和測序鑒定無誤后，得到質(zhì)粒pSCllA47k0VA。
[0074] 具體步驟如下：
[007引 酶切體系如下：1yg相應(yīng)質(zhì)粒或基因片段，2yL10xTbuffer，2yLBSA，抓相應(yīng) 的限制性內(nèi)切酶，dd&O定容至20yL。酶切條件37°C，3h。
[0076] 酶切產(chǎn)物上樣電泳，切膠回收線性條帶；將目的條帶與載體連接；
[0077] 連接反應(yīng)體系如下：3化目的片段，1化線性質(zhì)粒，lyLDNA連接酶，lyLlOx buffer,定容至10yL16°C連接過夜；
[0078] 向冰上解凍的感受態(tài)D冊a中加入上述連接產(chǎn)物5yL，混勻后冰上靜置30min; 42 °C熱擊Imin;冰上放置5min后，加入500yL預(yù)熱的LB培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)30-60min; 300化pm離屯、5min，棄上清；重新加入30yL新鮮LB培養(yǎng)基，混勻后涂布含Amp的LB固體 平板；37°C培養(yǎng)過夜，不超過16h。挑取單克隆細菌接種到含Amp的液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)， ISOrpm，14h;對挑取的單克隆細菌培養(yǎng)物進行菌落PCR，驗證外源基因OVA是否有效插入。
[0079] 驗證引物對：
[0080] 0VA-F2 :5' -GGGAAGGATCGACAGATTTG-3,
[0081] 0VA-R2 :5, -GCTAGTCACAATCACCACTTTC-3，
[0082]體系如下：菌液lyL，10xTaqbuffer2. 5yL，dNTP2yL，Taq酶 0. 5yL，引物各 1yLdd&O定容至25yL。擴增條件如下：95°C預(yù)變性5min;95°C變性30s，52°C退火30s， 72°C延伸90s，循環(huán)30次；72°C延伸5min，置于4°C。PCR產(chǎn)物上樣電泳，對符合要求的細菌 培養(yǎng)物提取質(zhì)粒；使用化〇1和EcoRV對上一步得到的質(zhì)粒進行雙酶切，上樣電泳驗證大 小，并與VectorNTI分析預(yù)測的酶切結(jié)果進行比對。對驗證正確的克隆送上海英濰捷基公 司進行測序。
[0083] 步驟2、痘苗病毒的重組和篩選
[0084] 2. 1痘苗病毒重組
[0085] (1)^了25培養(yǎng)瓶培養(yǎng)〇^-1細胞至80%單層；
[008引 似W0. 05M0I感染野生型痘苗病毒，37°C培養(yǎng)2小時；
[0087] (3)去除病毒液，按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000說明書轉(zhuǎn)染pSCllA47k0VA 至感染細胞中，培養(yǎng)48小時；
[0088] (4)收集細胞，反復(fù)凍融=次，進行超聲破碎后，保存于-80°C。
[0089] 2. 2VACV-AA4化-OVA病毒的篩選
[0090] (1)用6孔板培養(yǎng)CV-1細胞至80 %單層；
[00川 似取經(jīng)超聲破碎后的病毒懸液，做倍比稀釋，感染CV-1細胞，37°C培養(yǎng)2小時；
[0092] (3)每孔覆蓋3ml瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)2天；
[0093] (4)每孔加入2ml含X-gal的上層瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜；
[0094] (5)觀察藍斑產(chǎn)生情況，挑取孤立藍斑進行進一步篩選，連續(xù)單斑純化5代，至病 毒純化。
[0095] 步驟3、重組病毒的鑒定和純化
[0096] 3. 1重組病毒的鑒定
[0097] 將上述重組痘苗病毒VACV-AA4化-OVA經(jīng)BSC-1細胞連續(xù)傳代（> 10次）后，提 取重組病毒DNA，使用PCR驗證其中的A4化和OVA基因，并用WesternBlot驗證OVA蛋白 在感染細胞中的表達。
[0098] 3. 3. 1PCR鑒定A4化和OVA基因
[0099]A4化鑒定引物：
[0100]A47L-JDF1 :5，-AGTATAGGTGTATGGCATTAGCC-3，（野生型痘苗病毒第巧3679-巧3701 位，即序 列1的第745-767位）
[010"A47kJDRl:5' -AGTGACAGTGGATCTCTGAGG-3'（野生型痘苗病毒第 154889-154909 位的反向互補序列，即序列2的第262-282位的反向互補序列）
[0102]OVA鑒定引物：
[0103] 0VA-F1 :5' -CATGCCATGGATGGGCTCCATCGGCGCAG-3'
[0104] 0VA-R1 :5' -TCCCCCCGGGTTAAGGGGAAACACATCTGC-3'
[0105]W純化的重組痘苗病毒的基因組DNA為模板，用上述3對鑒定引物進行PCR檢測 反應(yīng)，同時分別設(shè)置野生型痘苗病毒和/或重組痘苗病毒VACV-0VA或VACV-AA4化的基因 組DNA為模板的對照。
[0106]PCR擴增體系為：
[0107] DNA 1|il dNTPmix(2. 5mM) 5|〇,1 正向引物F(10叫/