3、采用易錯(cuò)PCR技術(shù)，W重組質(zhì)粒pPICZaA-ca化為模板，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增獲得 ca化突變基因；
[0030] 4、將步驟3所得易錯(cuò)PCR產(chǎn)物及表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA用EcoRI和甜al雙酶切后連 接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入畢赤酵母X33感受態(tài)細(xì)胞，涂布于博來(lái)霉素抗性狂ec+)YTO平板上，即得 構(gòu)建好的重組ca化基因突變庫(kù)；
[0031] 5、將YTO平板上長(zhǎng)出的菌落逐一對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)接至含甲醇的S下酸甘油醋狂ecO平板 上，轉(zhuǎn)板后將平板置于30°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2地，然后采用剛果紅染色法觀察水解圈的大 小，同時(shí)每個(gè)平板分別W原始菌和不含有脂肪酶的空載體作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，獲得 高效生產(chǎn)脂肪酶的菌株。
[0032] 實(shí)施例2脂肪酶CALB突變體基因的獲得
[0033]Wlyg實(shí)施例1的高產(chǎn)脂肪酶的菌株基因組DNA為PCR反應(yīng)模板，設(shè)計(jì)正向引 物ca化-F:5 ' -AAAAAGAATTCAACAAACACGTCGCTGCTATGCTGACGATGCTTATTA-3 '，反向引物 ca化-R:5 ' -AAAAATCTAGAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTCTTTGAGATTTTGGTCTAAAAAA-3 '，其中斜 體字母部分分別為酶切位點(diǎn)EcoRI和甜al，為保證讀碼框正確，額外在正反向引物5'端各 加了五個(gè)堿基。PCR反應(yīng)在50yL總體積中進(jìn)行，反應(yīng)條件為：94°C變性5min后開(kāi)始循環(huán)， 然后94°C變性50s，58°C退火lmin，72°C延伸2min，共30個(gè)循環(huán)后，再于72°C延伸lOmin。 取3yLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，結(jié)果如圖1所示。取100yLPCR產(chǎn)物做 瓊脂糖凝膠電泳，按照膠回收試劑盒的步驟回收目的片段。
[0034] 實(shí)施例3表達(dá)載體祀T-28b(+) -ca化的構(gòu)建 陽(yáng)03引凝膠回收實(shí)施例2的PCR產(chǎn)物和pPICZ a A載體分別用EcoRI和甜al雙酶化并 通過(guò)凝膠回收試劑盒回收，然后進(jìn)行連接（16°C，1化），轉(zhuǎn)化D冊(cè)a感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克 隆，提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切分析驗(yàn)證，結(jié)果如圖2所示，并進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定，編碼所述脂肪酶 CALB突變體的核巧酸序列如SEQ ID No. 2所示，CALB突變體的氨基酸序列如SEQ ID No. 1 所示。構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒被稱為pPICZ a A-ca化。
[0036] 實(shí)施例4ca化在畢赤酵母X33感受態(tài)細(xì)胞中的表達(dá)及CALB突變體的純化與鑒定
[0037]l、ca化基因的表達(dá)
[0038]W測(cè)序驗(yàn)證的pPICZaA-ca化表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母X33感受態(tài)細(xì)胞；挑取陽(yáng)性 克隆，接種于含博來(lái)霉素的BMGY培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)至ODe。。約為8-10時(shí)，離屯、后菌體 轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY培養(yǎng)基中，30°C誘導(dǎo)表達(dá)20h，離屯、后收集上清。
[0039] 2、脂肪酶CALB突變體的純化與鑒定
[0040] NTA介質(zhì)填柱，用2倍柱體積的去離子水洗涂，然后加NiS〇4溶液至NTA介質(zhì)結(jié)合 度達(dá)到飽和，用5倍柱體積的NTA-0緩沖液（20mMTris-肥1pH7. 9,0. 5M化C1)洗柱。將上 述收集得到的上清加入到Ni2+-NTA樹脂柱中，反復(fù)加入2~3次后，用5倍柱體積的NTA-1 緩沖液（即含80mmol/L咪挫的NTA-0緩沖液）洗涂介質(zhì)W去除雜蛋白，最后用NTA-2緩 沖液（即含300mmol/L咪挫的NTA-0緩沖液）洗脫帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的脂肪酶，并進(jìn)行 SDS-PAGE分析（圖 3)。
[0041] 實(shí)施例5脂肪酶CALB突變體的酶活檢測(cè)
[0042] 脂肪酶的酶活分析液為：終濃度lOmM對(duì)硝基苯下醋（1. 76y1)作為底物，乙臘： 乙醇：憐酸鋼緩沖液（50mM，抑7. 0)為1:4:95 (體積比）作為反應(yīng)緩沖體系，加5y1酶液， 總反應(yīng)體系lml，45°C反應(yīng)一分鐘，其中每分鐘產(chǎn)生1iiM對(duì)硝基苯酪定義為1U。最優(yōu)的脂 肪酶CALB突變體酶活為野生型酶活的8. 7倍。
[0043] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可W對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，運(yùn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的運(yùn)些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 脂肪酶CALB突變體，其特征在于，其為：1)由SEQIDNo. 1所示的氨基酸序列構(gòu)成 的蛋白；或 2)SEQIDNo. 1所示氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且同等功能 的由1)衍生的蛋白。2. 編碼權(quán)利要求1所述突變體的基因。3. 如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNo. 2所示。4. 含有權(quán)利要求2或3所述基因的載體。5. 含有權(quán)利要求2或3所述基因或權(quán)利要求4所述載體的宿主細(xì)胞。6. 含有權(quán)利要求2或3所述基因的畢赤酵母工程菌。7. 含有權(quán)利要求2或3所述基因的畢赤酵母X33。8. 權(quán)利要求1所述突變體的制備方法，其特征在于，將權(quán)利要求7所述的畢赤酵母接種 于含博來(lái)霉素的BMGY培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)至0D_為8-10時(shí)，離心后收集菌體，將菌體 轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY中，30°C誘導(dǎo)表達(dá)20h，離心后收集上清；將上清加入到Ni2+-NTA樹脂 柱中，反復(fù)加入2~3次后，用5倍柱體積的NTA-I緩沖液洗滌介質(zhì)以去除雜蛋白，最后用 NTA-2緩沖液洗脫帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的脂肪酶突變體； 其中，所述NTA-I緩沖液為含有80mmol/L咪唑的NTA-O緩沖液，NTA-2緩沖液為含有 300mmol/L咪唑的NTA-O緩沖液。9. 權(quán)利要求1所述脂肪酶CALB突變體在洗滌劑加工領(lǐng)域中的應(yīng)用。10. 含有權(quán)利要求1所述脂肪酶CALB突變體的洗滌劑制品。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種脂肪酶CALB突變體及其制備方法，本發(fā)明利用基因體外定向進(jìn)化策略中易錯(cuò)PCR技術(shù)，對(duì)來(lái)源于克雷伯氏菌屬(Klebsiella？sp.)的野生型脂肪酶基因進(jìn)行體外誘變，通過(guò)鑒別培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，獲得高效生產(chǎn)脂肪酶的菌株。獲得的脂肪酶CALB突變體表達(dá)活性高，是野生型脂肪酶催化活性的8.7倍，可用于脂類水解相關(guān)行業(yè)中。通過(guò)對(duì)含有編碼所述CALB突變體的基因的工程菌進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵，可實(shí)現(xiàn)脂肪酶CALB突變體的批量生產(chǎn)。
【IPC分類】C12N15/81, C12N9/20, C12N15/55, C11D3/386, C12R1/84, C12N1/19
【公開(kāi)號(hào)】CN105200024
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510528429
【發(fā)明人】汪本助, 楊為華, 穆曉玲, 徐斌, 張雪鋒
【申請(qǐng)人】安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司
【公開(kāi)日】2015年12月30日
【申請(qǐng)日】2015年8月24日