來源于副溶血弧菌噬菌體的內(nèi)溶素及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種來源于副溶血弧菌隧菌體的內(nèi)溶素及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 副溶血性弧菌是革蘭氏陰性多形態(tài)桿菌或稍彎曲弧菌，為二級有害微生物，隸屬 弧菌科中的弧菌屬，它是一種人畜共患病菌，廣泛存在于近海岸的海水、海底沉積物W及魚 類、貝類等海產(chǎn)品之中。隨著抗生素的大量和長期使用，在食品和環(huán)境中，日趨嚴重的耐藥 型副溶血弧菌已影響人類感染副溶血弧菌疾病的治療，能否研究出新型的生物抑菌劑來替 代化學(xué)抗生素是目前科研人員面臨的一個挑戰(zhàn)。
[0003]隧菌體內(nèi)溶素是一類能夠裂解細菌細胞壁的裂解酶。盡管在1957年隧菌體內(nèi)溶 素裂解細菌的能力就被首次報道，但直到2001年化Ison等才證實純化的重組內(nèi)溶素可W 作為抗菌劑有效控制大鼠感染A族鏈球菌。到目前為止，內(nèi)溶素已被用來防控和檢測食品 中的食源性致病菌如金黃色葡萄球菌、李斯特菌和梭狀芽抱桿菌。與使用小分子抗生素用 于抗菌治療或預(yù)防相比，專一性的內(nèi)溶素不易導(dǎo)致抗性菌株的快速出現(xiàn)。在細菌耐藥性日 益嚴重的現(xiàn)在，尤其在市場對新型抗菌劑的需求空前提高，內(nèi)溶素不易產(chǎn)生抗性且裂解專 一性的特點，使其作為新型抗菌劑具有一定的優(yōu)勢。
[0004]雖然國內(nèi)利用基因工程技術(shù)構(gòu)建內(nèi)溶素生產(chǎn)菌株的工作已經(jīng)有了一定的進展，但 是在研究和生產(chǎn)過程中存在的重要的問題是，制備的內(nèi)溶素大多數(shù)都集中在革蘭氏陽性細 菌的防治和檢測，對于革蘭氏陰性細菌尤其是副溶血弧菌的防控研究仍較少。所W，針對副 溶血弧菌的耐藥性日趨嚴重及相關(guān)內(nèi)溶素缺乏的問題，本發(fā)明開發(fā)出能夠高效裂解副溶血 弧菌的內(nèi)溶素或內(nèi)溶素基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種來自副溶血弧菌隧菌體的具有顯著抑菌效果的內(nèi)溶素。
[0006] 本發(fā)明還提供所述的內(nèi)溶素在制備抑菌劑中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：
[0008] 一種具有環(huán)境消毒能力的隧菌體，該隧菌體單體為副溶血弧菌隧菌體，拉下名為 Vibriopar址aemolyticus地age,被命名為qdvpOOl，保藏編號：CCTCCN0:M2011143,保藏 日期為2011年4月26日。該副溶血弧菌隧菌體qdvpOOl為烈性隧菌體，具有裂解副溶血 弧菌的功能。
[0009] 該隧菌體對副溶血弧菌具有強烈的裂解作用，為工業(yè)化生產(chǎn)隧菌體及用于消毒殺 菌提供了隧菌體來源。
[0010] 一種來源于上述副溶血弧菌隧菌體的內(nèi)溶素，其氨基酸序列為SEQIDNo:1所示 的全部或部分氨基酸序列。經(jīng)過序列結(jié)構(gòu)分析，顯示該酶為隧菌體中的能夠裂解細菌細胞 壁的裂解酶，經(jīng)試驗證實，該氨基酸序列形成的蛋白具有較好的殺菌活性。
[0011] 編碼所述的內(nèi)溶素的基因，所述基因的核巧酸序列如SEQIDNo:2所示。
[0012] 含有所述的基因的表達載體、工程菌或細胞系。
[0013] 所述原核細胞表達載體為祀T-30a(+)。
[0014] 所述工程菌為大腸桿菌Rosseta(DE3)。
[0015] 一種所述的內(nèi)溶素在制備抑菌劑中的應(yīng)用。目前尚未有文獻公開過副溶血弧菌隧 菌體qdvpOOl能夠產(chǎn)生裂解副溶血弧菌細胞壁的裂解酶，而本發(fā)明的內(nèi)溶素具有該功能， 對副溶血弧菌具有有效的殺菌活性。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的內(nèi)溶素通過市場上已有的適合表達載體表達、純 化后，體外對副溶血弧菌表現(xiàn)出顯著的殺菌效果，可用于副溶血弧菌抑菌劑的制備。
【附圖說明】
[0017] 圖1為內(nèi)溶素蛋白進行結(jié)構(gòu)域分析預(yù)測圖； 陽018] 圖2為內(nèi)溶素蛋白在大腸桿菌中高效表達圖譜，M為marker，！為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo) 的細菌總蛋白，2、3、4、5過柱過程中收集的洗脫液，6為儀柱純化后的融合蛋白，7為超濾濃 縮脫鹽后的融合蛋白，8為經(jīng)過誘導(dǎo)的細菌總蛋白；
[0019] 圖3為內(nèi)溶素蛋白裂解副溶血弧菌ATCC17802的吸光值變化圖譜；
[0020] 圖4為內(nèi)溶素蛋白裂解副溶血弧菌ATCC17802的濁度變化圖譜。
【具體實施方式】
[0021] 下面通過具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的具體說明。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā) 明的實施并不局限于下面的實施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落 入本發(fā)明保護范圍。
[0022] 在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所采用的設(shè)備和原料等 均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常 規(guī)方法。
[0023] 本發(fā)明試驗設(shè)及的菌株：副溶血弧菌VP17802(保藏號為ATCC17802)，購買于美 國ATCC中屯、，副溶血弧菌VIB304、副溶血弧菌VIB461、副溶血弧菌VIB800和副溶血弧菌 VP14-90、VP1. 2、VP2. 1、VP3. 2、VP4. 1均保存在中國海洋大學(xué)食品安全實驗室。
[0024] 本發(fā)明設(shè)及的副溶血弧菌隧菌體，該隧菌體qdvpOOl保存于中國典型培養(yǎng)物保 藏中屯、，地址：中國武漢、武漢大學(xué)，保藏編號：CCTCCNO:M2011143,保藏日期為2011年 4月26日，分類學(xué)命名：副溶血弧菌隧菌體qdvpOOl(Vibriopar址aemolyticusphage qdvpOOl)〇
[00巧]2216E培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限責(zé)任公司； 陽0%] LB液體培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；
[0027] 質(zhì)粒祀T30a和大腸桿菌Rosetta(DE3)，北京康為世紀公司；
[0028]NiSe地aroseTM6化StFlow填料，美國GE公司；
[0029]異丙基-P-D-硫代半乳糖巧（IPTG)，北京索萊寶科技有限公司。
[0030] 實施例1 :內(nèi)溶素蛋白功能預(yù)測
[0031] 本發(fā)明人從污水中分離出一株副溶血弧菌的烈性隧菌體qdvpOOl。經(jīng)全基因組測 序和分析，鑒定該隧菌體0RF60編碼的蛋白在氨基酸序列上與弧菌隧菌體ICPl基板和尾 部水解酶有56%的相似度。使用SMART軟件對0RF60編碼的蛋白LysqdvpOOl進行結(jié)構(gòu) 域預(yù)測分析。結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果如圖1所示，LysqdvpOOl的9-65氨基酸區(qū)間為高度保守功 能區(qū)域，屬于PG_binding(PF01471)域，該家族與細胞壁膚聚糖結(jié)合有關(guān)。LysqdvpOOl的 123-216氨基酸區(qū)間為高度保守的功能區(qū)域，屬于CHAP家族（PF05257)，該家族與原核細胞 細胞壁膚聚糖水解有關(guān)。
[0032] 實施例2 :內(nèi)溶素在大腸桿菌中的高效表達
[0033] 1、重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0034] 根據(jù)內(nèi)溶素基因序列（SEQIDNo:2)，設(shè)計引物，上游引物：CGGGATCCATGA