水稻轉(zhuǎn)化事件g6h1及其特異性pcr鑒定方法
【專利說明】水稻轉(zhuǎn)化事件G6H1及其特異性PCR鑒定方法 (-)技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種水稻轉(zhuǎn)化事件及其特異性鑒定方法，特別設(shè)及一種水稻轉(zhuǎn)化事件 G6H1及其特異性PCR檢測方法。 (二）【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是一種重要的糧食作物。隨著植物基因工程的發(fā)展，通過導(dǎo)入外源基因來進(jìn) 行遺傳改造成為遺傳育種的主要手段之一。在水稻生產(chǎn)中，抗蟲和抗除草劑都是非常需要 的農(nóng)藝性狀。抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻能夠大幅度地降低化學(xué)殺蟲劑的使用量，從而降低生產(chǎn)成本 并且減少農(nóng)藥對環(huán)境和農(nóng)作物產(chǎn)品的污染。
[0003] 抗草甘麟水稻可W大幅度降低防治雜草所需要的農(nóng)業(yè)勞動力，降低勞動力的投 入，減少雜草對水稻生長發(fā)育的影響。近年來水稻栽培方法的變化使雜草問題變得嚴(yán)重，目 前已經(jīng)成為水稻生產(chǎn)中的重要問題。特別是直播稻和免耕法的推廣使雜草有了相當(dāng)好的發(fā) 芽和繁殖機(jī)會，在很多地區(qū)已經(jīng)造成雜草的嚴(yán)重發(fā)生。免耕法使雜草種子、雜草稻、野生稻 種子在大田中的成活能力得到提高。盡管選擇性除草劑的使用能夠部分地解決雜草問題， 但是雜草問題仍然沒有得到根本性的解決。例如南方沿海地區(qū)的雜草稻和野生稻和栽培水 稻非常相似，市場上仍然沒有良好的除草劑選擇性殺滅雜草稻。因此抗草甘麟轉(zhuǎn)基因水稻 的應(yīng)用可W使稻田雜草防治變得更為簡單、高效和低成本。
[0004] 利用外源基因轉(zhuǎn)化植物時，因?yàn)橥庠椿蛟谌旧w上隨機(jī)插入，往往得到的是一 個轉(zhuǎn)化體群體。通常把外源基因在基因組插入位點(diǎn)的側(cè)翼區(qū)序列不同的轉(zhuǎn)化子稱為獨(dú)立轉(zhuǎn) 化事件。轉(zhuǎn)化體群體中包含大量獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件，其中每個事件都是獨(dú)特的。外源基因在 植物中的表達(dá)受到外源基因所插入的染色體位置的影響。運(yùn)可能源自染色質(zhì)結(jié)構(gòu)或者整合 位點(diǎn)附近轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的影響。因此相同基因在不同轉(zhuǎn)化事件中的表達(dá)水平具有很大的差 異，在表達(dá)的空間或時間模式上也可能存在差異，而且外源基因的插入還可能影響內(nèi)源基 因的表達(dá)。因此，每個獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件對受體植物的影響都是不同的。目前并不清楚外源基因 在植物中的插入位點(diǎn)整合規(guī)律，在研發(fā)過程中需要產(chǎn)生數(shù)百乃至數(shù)千的不同轉(zhuǎn)化事件，并 從中篩選具有預(yù)期轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和模式，且不影響植株本身農(nóng)藝性狀的獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件。 在抗蟲抗草甘麟轉(zhuǎn)基因水稻培育中，獲得優(yōu)良的獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件在生產(chǎn)應(yīng)用上具有重要的價 值。 (H)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是提供一種優(yōu)良的水稻轉(zhuǎn)化事件G6H1，該轉(zhuǎn)化事件可實(shí)現(xiàn)將外源基因 引入到水稻品種中，賦予受體水稻具有抗蟲抗草甘麟的能力；抗蟲抗草甘麟基因在受體水 稻中能夠穩(wěn)定遺傳；抗蟲抗草甘麟基因的表達(dá)對受體水稻的農(nóng)藝性狀不會產(chǎn)生不良影響。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0007] 本發(fā)明提供一種在水稻基因組特定位點(diǎn)中單拷貝插入外源基因序列的水稻轉(zhuǎn)化 事件G6H1，所述轉(zhuǎn)化事件WSEQIDNO. 1所示的核巧酸序列為外源基因的左側(cè)翼區(qū)，WSEQ IDNO. 3所示的核巧酸序列為外源基因的右側(cè)翼區(qū)。本發(fā)明所述轉(zhuǎn)化事件是利用農(nóng)桿菌侵 染法，將含有抗蟲抗草甘麟基因表達(dá)框的T-DNA導(dǎo)入水稻細(xì)胞中，通過再生含有外源基因 的水稻細(xì)胞獲得水稻轉(zhuǎn)基因群體。利用分子生物學(xué)方法篩選抗蟲基因和抗草甘麟基因表達(dá) 量都高的轉(zhuǎn)化株系，并通過生物測定的方法篩選抗蟲性能和抗草甘麟性能都能夠滿足生產(chǎn) 需要的轉(zhuǎn)化事件，從而獲得具有良好抗蟲性能和高抗草甘麟能力的水稻轉(zhuǎn)化事件G6H1。
[0008] 進(jìn)一步，所述外源基因包括抗蟲基因和抗草甘麟基因，所述抗蟲基因由二個化 基因組成，優(yōu)選抗蟲基因由基因化ylAb和基因Vip3H融合而成，核巧酸序列為SEQID ^.4中的2268-656669部分，優(yōu)選所述抗草甘麟基因的核巧酸序列為56〇10^.4中 8787-10323bp部分。
[0009] 進(jìn)一步，優(yōu)選本發(fā)明所述外源基因的核巧酸序列為SEQIDNO. 2所示。
[0010] 本發(fā)明還提供一種含水稻轉(zhuǎn)化事件G6化的水稻細(xì)胞，構(gòu)建含有SEQIDNO. 2所示 核巧酸序列的T-DNA載體，然后通過農(nóng)桿菌侵染法將T-DNA導(dǎo)入水稻細(xì)胞，篩選獲得含有水 稻轉(zhuǎn)化事件G6H1的水稻細(xì)胞。本發(fā)明構(gòu)建的含有水稻轉(zhuǎn)化事件G6H1的水稻細(xì)胞的受體水 稻具有抗蟲抗草甘麟能力，特別賦予受體水稻具有抗稻縱卷葉懼抗草甘麟能力。
[0011] 本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)化事件G6化是由插入T-DNA左臂側(cè)翼的水稻基因組序列SEQID NO. 1、外源基因T-DNA序列（不包括載體框架，左邊界含部分pZmUbi-1序列）SEQIDNO. 2 和插入T-DNA右臂側(cè)翼的水稻基因組序列SEQIDNO. 3構(gòu)成，其核巧酸序列為SEQIDNO. 7。 該轉(zhuǎn)化事件通過遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得。在遺傳轉(zhuǎn)化過程中，外源基因核巧酸被隨機(jī)地整合在 植物基因組中，獲得的轉(zhuǎn)化事件是獨(dú)特的而且能夠穩(wěn)定遺傳。運(yùn)種轉(zhuǎn)化事件可W通過有性 雜交或體細(xì)胞雜交技術(shù)重組到不同的水稻種質(zhì)資源中去，實(shí)現(xiàn)對水稻的改良。本領(lǐng)域的技 術(shù)人員可W理解，通過天然或人工的方式，在所述轉(zhuǎn)化事件的基礎(chǔ)上通過插入、缺失、取代、 替換、添加一個或多個堿基獲得功能等同的亞結(jié)構(gòu)，也屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0012]本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)化事件G6H1含有能賦予轉(zhuǎn)基因水稻具有抗蟲抗草甘麟能力的抗 蟲表達(dá)框和抗草甘麟表達(dá)框。
[0013] 本發(fā)明提供的抗蟲基因是由crylAb和Vip3H基因融合獲得，融合基因全長為 4299bp，核巧酸序列為載體序列（SEQIDNO. 4)中的2268-656化P，所編碼的蛋白質(zhì)由1433 個氨基酸殘基組成，蛋白分子量大小約為159kDa。編碼的氨基酸序列為SEQIDNO. 5。 化ylAb是一種殺蟲能力比較強(qiáng)的化晶體殺蟲蛋白質(zhì)，Vip3類殺蟲蛋白質(zhì)和目前已經(jīng)商業(yè) 化種植抗蟲植物殺蟲蛋白質(zhì)的殺蟲機(jī)理是不同，因此其融合蛋白具有提高殺蟲活性，延緩 害蟲交互抗性的產(chǎn)生，有利于抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻的長期有效利用。
[0014] 本發(fā)明提供了一種抗蟲表達(dá)框，該表達(dá)框由玉米polyubiquitin-1基因啟動子 (pZmUbi-1)、抗蟲融合基因crylAb-Vip3和玉米陽Pcarbo巧lase基因（P巧C)終止子構(gòu) 成。其中玉米polyubiquitin-1基因啟動子（pZmUbi-1)大小為2.化b，核巧酸序列為載體 序列（SEQIDN0.4)中的204-2263bp，是組成型啟動子，可驅(qū)動目的基因在玉米所有組織中 表達(dá)。PEPcarbo巧lase基因（P巧C)終止子，來源于玉米，大小為0. 2化，核巧酸序列為載 體序列（SEQIDNO. 4)中的 6570-676化P。
[0015] 本發(fā)明提供的抗草甘麟基因是5-締醇丙酬莽草酸-3-憐酸合成酶（EPSP巧基因。 草甘麟是一種廣譜滅生性除草劑，它通過抑制植物中5-締醇丙酬莽草酸-3-憐酸合成酶的 活性，導(dǎo)致植物不能合成芳香族氨基酸而死亡。為了方便雜草控制，通過在作物轉(zhuǎn)入對草甘 麟具有抗性的EPSPS可W使作物獲得抗草甘麟的能力，實(shí)現(xiàn)在農(nóng)作物生長的同時選擇性地 除草。本發(fā)明提供的抗草甘麟表達(dá)框是由玉米polyubiquitin-1基因啟動子（pZmUbi-1)， 5'端連有一段編碼AHAS基因葉綠體信號膚的G170巧PSPS)(核巧酸序列為載體序列（SEQ IDNO. 4)中8795-10323bp，編碼的氨基酸序列為沈QIDNO. 6)和陽Pcarbo巧lase基因 (P巧C)終止子（載體序列沈QIDNO. 4中10327-1051化P)構(gòu)成。
[0016] 本發(fā)明提供能夠特異性檢測樣品中是否含有轉(zhuǎn)化事件G6H1存在的方法，包括如 下方法中的至少一種：
[0017] 1)根據(jù)沈QIDNO. 7(即沈QIDNO. 1、沈QIDNO. 2 和沈QIDNO. 3 的聯(lián)合） 設(shè)計特異性PCR檢測引物，如用于檢測外源基因左側(cè)是否與水稻基因組特異性位點(diǎn)連接的 LB-SP4和RiceG8-R，用于檢測外源基因右側(cè)是否與水稻基因組特異性位點(diǎn)連接的特異性 引物RB-SP和化ceG8-GB。
[0018] 左側(cè)翼檢測引物：
[0019]RiceG8-R(5'TCGATCTGCTGCAGCTTGGTGCCGG，水稻基因組中）；
[0020] LB-SP4 巧 'TGGTTGGTGTCCGTTAGACTCGTCGA，T-DNA左邊界）；
[00川PCR產(chǎn)物的長度計算為：188bp。
[002引右側(cè)翼檢測引物：
[0023]化ceG8-GB: (5,TATAAGTGTTCCCTCCCCTGTTTCAAC，水稻基因組中）；
[0024]RB-SP: (5'CGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGA，T-DNA右邊界）；
[002引 PCR產(chǎn)物的長度計算為：468bp。
[0026] 本發(fā)明所述PCR反應(yīng)體系為：
[0027] 10X擴(kuò)増緩沖液 5|XL dNTF混合物200nmol/L正向引物 lOpmol 反向引物 10pmol 基因組DNA0.1~2H裝 TaqDNA聚合酶 2.5,iiL MgCl： 1.5mm掃1法 加雙蒸水至洗枯。
[002引 PCR反應(yīng)條件為：32個循環(huán)，每個循環(huán)是95°C，45秒；65°C，50秒；72°C，30秒。
[0029] 2)提取植物基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶化nl單酶切；W地高辛標(biāo)記的抗草甘麟 基因G170(SEQIDN0.4中8787-10323bp)基因全長DNA作為探針，檢測抗草甘麟基因是否 存在。
[0030] 或提取植物基因組DNA經(jīng)過限制性內(nèi)切酶Smal單酶切，地高辛標(biāo)記的crylAb全 長DNA作為探針（SEQIDNO. 4中的2268-4220bp)，雜交到尼龍基質(zhì)膜上W后巧光顯影，檢 測抗蟲基因是否存在。DNA提取、探針制作方法和Southern雜交方法依據(jù)J.薩姆布魯克 《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。
[0031] 3)從植物中提取蛋白質(zhì)，用抗蟲蛋白或抗草甘麟蛋白抗體為一抗，進(jìn)行Western 分析，檢測抗蟲蛋白或抗草甘麟蛋白的表達(dá)水平。蛋白提取方法、Western方法遵照J(rèn).薩 姆布魯克《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》的方法。
[0032] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明提供一種優(yōu)良的水稻轉(zhuǎn) 化事件G6H1，該轉(zhuǎn)化事件可實(shí)現(xiàn)將外源基因特異性引入到水稻品種中，賦予受體水稻具有 抗蟲抗草甘麟的能力；抗蟲抗草甘麟基因在受體水稻中能夠穩(wěn)定遺傳；抗蟲抗草甘麟基因 的表達(dá)對受體水稻的農(nóng)藝性狀不會產(chǎn)生不良影響。 (四）
【附圖說明】
[003引圖1、實(shí)施例1中含目的基因的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖，LB和RB:T-DNA的邊界序列；pZmUbi-1 :玉米polyubiqutin-1 啟動子；G170-AHAS:抗草甘麟EPSPS基因；CrylAb/Vip3H: 抗蟲化融合基因crylAb/Vip3H。
[0034] 圖2、抗蟲抗草甘麟水稻基因組Southern雜交后的巧光顯影圖；基因組經(jīng)Smal單 酶切；W地高辛標(biāo)記的化ylAb的DNA作為探針雜交到尼龍基質(zhì)膜上W后巧光顯影；圖右側(cè) 為DNA長度標(biāo)準(zhǔn)化P)標(biāo)記。
[0035] 圖3、抗蟲抗草甘麟水稻基因組Southern雜交后巧光顯影圖；基因組DNA經(jīng)過 化nl酶切，地高辛標(biāo)記的G170全長DNA作為探針，雜交到尼龍基質(zhì)膜上W后巧光顯影，圖右 側(cè)為DNA長度標(biāo)準(zhǔn)化P)。
[0036] 圖4、Western分析抗蟲蛋白質(zhì)化ylAb/Vip3H在不同組織器官中的表達(dá)水平；+為 陽性對照；-為陰性對照（非轉(zhuǎn)基因水稻）；M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（kD);材料：G細(xì)1，葉片、 莖、根的上樣量是相同的鮮重，種子是W20%的量上樣；箭頭指殺蟲蛋白質(zhì)的信號帶。
[0037] 圖5、Western分析抗草甘麟