基于rna聚合酶ⅰ的rsv微型復(fù)制基因組及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體地，設(shè)及建立抗病毒藥物的篩選 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 呼吸道合胞病毒（HumanRespiratorySyn巧tialViru，RSV)是世界范圍內(nèi)引起 嬰幼兒和兩歲W下兒童下呼吸道感染的最重要的病毒性病原，同時(shí)也在老年人和免疫缺陷 人群引起嚴(yán)重感染。目前，利己韋林和帕利珠單抗是僅有的用于RSV治療和預(yù)防的藥物，然 而利己韋林由于噴霧給藥途徑、藥效不佳及存在致崎作用，阻礙了其在臨床應(yīng)用，帕利珠單 抗主要用于2歲W下高危兒童且且價(jià)格昂貴，也未得到廣泛使用。因而，開發(fā)新的抗RSV藥 物成為亟待解決的問題。而建立高通量的抗RSV藥物篩選系統(tǒng)是研發(fā)新的抗RSV藥物的核 屯、。
[0003] 快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的RSV定量方法是篩選抗RSV藥物的基礎(chǔ)，隨著生物技術(shù)的不斷 發(fā)展，愈來愈多的方法被用于RSV定量檢測(cè)，但都存在一定問題，難W用于高效篩選抗RSV 藥物。如：實(shí)時(shí)定量PCR因其高敏感和高特異性被用于定量RSV，但該方法不能區(qū)分活病毒 和死病毒，限制了其在抗RSV藥物篩選中的應(yīng)用；酶聯(lián)免疫吸附法巧LISAs)需要大量特異 性抗體，導(dǎo)致該方法價(jià)格昂貴，難W用于大規(guī)模篩選抗RSV藥物；基于細(xì)胞病變效應(yīng)（CP巧 的RSV定量方法存在耗時(shí)較長(zhǎng)、工作量較大、容易受操作人員主觀因素影響等缺點(diǎn)，也不適 用于大規(guī)模樣品的檢測(cè)。
[0004] 隨著負(fù)鏈RNA病毒反向遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用N、P、M2-1、L四種蛋白和病毒編 碼蛋白被報(bào)告基因取代了的微型復(fù)制基因組（Minigenome)模擬RSV的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程成 為了現(xiàn)實(shí)。W此為基礎(chǔ)，有研究者構(gòu)建了T7聚合酶驅(qū)動(dòng)的RSV微型復(fù)制基因組，并用于定 量RSV和篩選抗RSV藥物，獲得了不錯(cuò)的效果。但是，T7聚合酶驅(qū)動(dòng)的RSV復(fù)制系統(tǒng)需要 通過表達(dá)T7RNA聚合酶的重組痘苗病毒、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或建立穩(wěn)定表達(dá)T7RNA聚合酶的細(xì)胞系 等方法提供T7RNA聚合酶，導(dǎo)致難W在宿主細(xì)胞內(nèi)獲得高水平的T7RNA聚合酶，進(jìn)而限制了 該系統(tǒng)的效率。另外，T7聚合酶驅(qū)動(dòng)的RSV微型復(fù)制基因組轉(zhuǎn)錄后，會(huì)在的3'末端留有多 余的外源基因片段，為去除該多余的基因片段，需要在微型基因組3'末端添加下肝核酶， 通過下肝核酶將多余的基因片段切除掉，由于下肝核酶切割效率有限，因而限制了功能性 微型復(fù)制基因組的轉(zhuǎn)錄。
[000引真核RNA聚合酶包括立種，分別是RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶III，其 中RNA聚合酶I位于真核細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄核糖體RNA，RNA聚合酶II位于細(xì)胞質(zhì)中， 負(fù)責(zé)合成信使RNA(mRNA)的前體，RNA聚合酶III位于細(xì)胞質(zhì)中，負(fù)責(zé)合成轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNAs)。 利用真核RNA聚合酶啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體，需要具有RNA聚合酶的啟動(dòng)子，運(yùn)樣的表達(dá)載 體能夠在真核細(xì)胞中瞬時(shí)或永久表達(dá)目標(biāo)基因。用于真核表達(dá)的載體通常采用RNA聚合酶 II的啟動(dòng)子，但RNA聚合酶II的啟動(dòng)子并不能用于制備的RSV微型復(fù)制基因組。
[0006] 因而需要提供一種可在真核細(xì)胞表達(dá)的RSV微型復(fù)制基因組，及包含該RSV微型 復(fù)制基因組的載體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供了一種基于RNA聚合酶I的RSV微型復(fù) 制基因組。
[000引本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種包含基于RNA聚合酶I的RSV微型復(fù) 制基因組的真核表達(dá)載體。
[0009] 本發(fā)明要解決的第=個(gè)技術(shù)問題是包含基于RNA聚合酶I的RSV微型復(fù)制基因組 的真核表達(dá)載體在篩選抗RSV化合物中的應(yīng)用。
[0010] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下述技術(shù)方案：
[0011] 一種基于RNA聚合酶I的RSV微型復(fù)制基因組，其包含RNA聚合酶I啟動(dòng)子和 Gaussia巧光素酶（Glue)報(bào)告基因，所述微型復(fù)制基因組序列如seqIDNo:l所示。
[0012] 在基于RNA聚合酶I的RSV微型復(fù)制基因組中，我們保留了RSV前導(dǎo)序列化eader re邑ion/邑enomicpromoter)、牽專錄起女臺(tái)f言號(hào)（Genestartsignal，GS)、牽專錄終ihf言號(hào)（Gene endsi即al，GE)和尾隨序列（Trailerregion/antigenomicpromoter)等順式作用元件 (Cis-actingelements),用Glue(Gaussialuciferase)基因替代了RSV全部編碼基因，并 分別在基因組兩端添加了RNA聚合酶I啟動(dòng)子和終止子，獲得了基于RNA聚合酶I驅(qū)動(dòng)的 RSV微型復(fù)制基因組。
[0013] 通常在建立病毒微型復(fù)制子時(shí)，需要含有T7聚合酶的啟動(dòng)子，但是T7聚合酶存在 技術(shù)背景中所述的兩大缺點(diǎn)。我們發(fā)現(xiàn)采用含有RNA聚合酶I啟動(dòng)子的RSV微型復(fù)制基因 組能夠避免運(yùn)兩缺點(diǎn)。
[0014] 一種基于RNA聚合酶I的RSV微型復(fù)制基因組的pHM-RSV-Gluc表達(dá)載體，所述 pHM-RSV-Gluc表達(dá)載體的序列如seqIDNo:2所示。該序列全長(zhǎng)5638bp，其中228-1390bp 之間為基于RNA聚合酶I的RSV微型復(fù)制基因組，704-126化P之間為Glue報(bào)告基因， 234-470bp之間為RNA聚合酶1啟動(dòng)子。所述pHM-RSV-Gluc表達(dá)載體的構(gòu)建方法如下：構(gòu) 建抑M質(zhì)粒；構(gòu)建基于RNA聚合酶I的RSV微型復(fù)制基因組；將所述RSV微型復(fù)制基因組裝 入pHM質(zhì)粒，即獲得pHM-RSV-Gluc表達(dá)載體。
[0015] 其中抑M載體的構(gòu)建方法包括但不限于：WPCDNA3. 1 (+)質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增 1253bp-2080bp之間的DNA片段，所用的PCR引物為的上游引物為MF，含有MluI酶切位點(diǎn)， 序列如seqIDNo:3所示，所用的PCR的下游引物為：MR，含有SmaI酶切位點(diǎn)，序列如seq IDNo:4所示。用MluI和SmaI雙酶切PCR擴(kuò)增的DM片段，回收82化P的酶切后的PCR 擴(kuò)增片段，即獲得抑M插入片段。同時(shí)用MluI和SmaI雙酶切所述PCDNA3. 1 (+)質(zhì)粒，并 回收3579bp的DNA片段，獲得第一P歷載體片段，連接抑M插入片段和第一P歷載體片段， 即獲得pHM質(zhì)粒，即刪除PCDNA3. 1 (+)質(zhì)粒上233-1157bp之間片段，即獲得pHM質(zhì)粒，其中 所述PCDNA3. 1 (+)質(zhì)粒233-1157bp之間片段包含CMV啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子、MCS和BGH反向 引物序列。
[001引所述pcDNA3. 1 (+)質(zhì)粒購(gòu)買自Invitrogen公司。
[0017] 其中，含有Glue報(bào)告基因和RNA聚合酶1啟動(dòng)子的RSV微型復(fù)制子的構(gòu)建方法包 括但不限于全基因合成方法或PCR擴(kuò)增法，優(yōu)選為全基因合成方法，同時(shí)為保證穩(wěn)定性，進(jìn) 一步將合成的Glue報(bào)告基因連接在pUC57質(zhì)粒體上，獲得pUC57 -RSV-Gluc質(zhì)粒，其中所 述微型復(fù)制子的全基因合成和連接是由上海生工完成，其中所述的微型復(fù)制子也可W連接 在其他的質(zhì)粒上。所述pHM-RSV-Gluc表達(dá)載體的組裝方法為：
[001引 利用MluI和EcoRV內(nèi)切酶雙酶切所述PUC57 -RSV-Gluc載體和抑M載體，回收PUC57 -RSV-Gluc質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物中1163bp片段，獲得RSV-Gluc片段；回收抑M載體的酶 切產(chǎn)物中4475bp的片段，獲得第二pHM載體片段，用T4DNA連接酶連接RSV-Gluc片段和第 二抑M載體片段，即獲得pHM-RSV-Gluc載體。
[0019] 其中DNA片段的PCR、酶切與回收、載體的酶切與回收化及插入片段與載體片段或 質(zhì)粒片段間的連接可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)手段。
[0020] 采用相似或相同的制備原理，基于RNA聚合酶I的RSV微型復(fù)制基因組也可W連 接至其他的表達(dá)載體中或修改的表達(dá)載體中，表達(dá)載體的修改方式不限于本申請(qǐng)例舉的方 法。
[0021] 所述pHM-RSV-Gluc表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞后不能表達(dá)巧光素酶報(bào)告基因，僅 當(dāng)RSV病毒同時(shí)感染轉(zhuǎn)染了pHM-RSV-Gluc表達(dá)載體的細(xì)胞時(shí)，才能表達(dá)巧光素酶。
[0022] 在一個(gè)實(shí)施例中，為確定pHM-RSV-Gluc轉(zhuǎn)染的肥P-2細(xì)胞中能夠正確表達(dá)報(bào)告基 因，我們將肥P-2細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板，24h后，接種RSV病毒，接種病毒后2地，參照轉(zhuǎn)染試 劑說明書建議量轉(zhuǎn)染pHM-RSV-Gluc載體，與此同時(shí)我們?cè)O(shè)立2個(gè)陰性對(duì)照組，分別為轉(zhuǎn)染 pHM-RSV-Gluc載體但不接種RSV組和接種RSV但不轉(zhuǎn)染pHM-RSV-Gluc載體組，和1個(gè)空白 對(duì)照組，為不接種RSV也不轉(zhuǎn)染pHM-RSV-Gluc載體，轉(zhuǎn)染后4化檢測(cè)Gaussia巧光（RLU) 信號(hào)。僅當(dāng)轉(zhuǎn)染pHM-RSV-Gluc載體并接種RSV病毒時(shí)檢測(cè)到了Gaussia巧光素酶（Glue) 的巧光信號(hào)（R