in。
[0026] 酶活測(cè)定方法：1血反應(yīng)體系中含有200yL發(fā)酵液細(xì)胞，800yL pH 7.0憐酸鹽緩 沖溶液Ig/L底物，30°C條件下，反應(yīng)30min，終止反應(yīng)。酶活力定義為：
[0027]HPLC分析：正相HPLC分析丫 -內(nèi)酷胺底物選擇性和轉(zhuǎn)化率，色譜柱為化icel 化^曰19曰〇4 45-扎流動(dòng)相為乙臘與異丙醇（比例為8:2)，流速為0.3血/111111，波長(zhǎng)為230皿。
[0028]HPLC化學(xué)純度分析：產(chǎn)品純度檢測(cè)：色譜柱為DiamonsilC18(2) ,250X4. 6mm，流 動(dòng)相為甲醇與水（比例為9:1)，流速為ImL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為225nm。
[0029]實(shí)施例 1 :重組Bacillussubtilis168/pMA5-delm菌株構(gòu)建
[0030]WDelftiasp.CGMCC5755基因組為模板，W化rward和Reverse為上下游引物 擴(kuò)增獲得目的基因片段（約1230bp)，命名為delm。將PCR產(chǎn)物純化后，經(jīng)Ndel和BamHI 雙酶切，回收，與經(jīng)過(guò)相同限制性內(nèi)切酶線性化處理的載體pM5連接，連接后轉(zhuǎn)入大腸桿 菌E.coliJM109,涂布氨節(jié)青霉素抗性平板，驗(yàn)證陽(yáng)性克隆子。對(duì)連接成功的重組質(zhì)粒 pMA5-delm重新轉(zhuǎn)化Bacillussubtilis168感受態(tài)細(xì)胞，涂布卡那霉素抗性平板。驗(yàn)證轉(zhuǎn) 化成功的重組菌株Bacillussubtilis168/pMA5-delm。
[0031] 實(shí)施例2 :重組枯草芽抱桿菌的發(fā)酵產(chǎn)酶
[0032]W過(guò)夜培養(yǎng)的重組Bacillussubtilis168/pMA5-delm為種子液，按照2~5%的 接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)，攬拌轉(zhuǎn)速300~70化pm，控制溶氧最低為15%，pH維 持7. 0左右。發(fā)酵12h，WeOOOXg常溫離屯、收集菌體，W0. 〇2mol/L的憐酸鹽（pH7. 0)緩 沖溶液洗涂細(xì)胞，凍干低溫保存。
[0033] 實(shí)施例3 :重組枯草芽抱桿菌的固定化
[0034] 將Ig凍干細(xì)胞充分溶解于lOmL去離子水中，與3%的海藻酸鋼溶液40mL混合攬 拌，通過(guò)注射器枕頭將上述混合液W5cm高度注入1%的氯化巧溶液中立即形成光滑的微 球體，并將此固定化小球保持在4°C的上述氯化巧溶液中硬化30min，進(jìn)而在0. 3 %的戊二 醒溶液中進(jìn)一步硬化，用生理鹽水洗涂后將固定化細(xì)胞儲(chǔ)存在4°C冰箱中備用。經(jīng)測(cè)定，所 得固定化細(xì)胞的活力回收率為48%。
[0035] 實(shí)施例4 :重組枯草芽抱桿菌不對(duì)稱水解r-內(nèi)酷胺條件優(yōu)化
[0036] (1)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化的最適溫度：lmL反應(yīng)體系中，含有終濃度為Ig/L重組枯草芽 抱桿菌凍干細(xì)胞的憐酸鹽緩沖溶液（pH7.0,0.Imol/L)，分別于10、20、30、40、50、60、70、 80°C溫度下預(yù)熱lOmin，加入底物丫-內(nèi)酷胺至終濃度為5g/L繼續(xù)于上述溫度下震蕩反應(yīng) 30min，加熱終止反應(yīng)，HPLC檢測(cè)底物的轉(zhuǎn)化率。結(jié)果如表1所示，綜合溫度穩(wěn)定性，確定最 適轉(zhuǎn)化溫度30°C。
[0037]表1反應(yīng)溫度對(duì)重組枯草芽抱桿菌整細(xì)胞水解拆分丫 -內(nèi)酷胺的影響
[0038]
[0039]
[0040] (2)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化的最適抑：1血反應(yīng)體系中，含有終濃度為Ig/L的重組枯草 芽抱桿菌凍干細(xì)胞的0.Imol/L不同抑值的緩沖溶液（pH6. 0 - 8. 0憐酸鹽緩沖液，pH 9. 0-11.OTris-HCl緩沖液），30°C溫浴lOmin，加入終濃度為5g/L的底物丫-內(nèi)酷胺，于最 適溫度下，轉(zhuǎn)化反應(yīng)化，終止反應(yīng)，HPLC檢測(cè)底物的變化。最適轉(zhuǎn)化抑為9. 0。
[0041] 表2緩沖液抑對(duì)重組枯草芽抱桿菌整細(xì)胞水解拆分丫 -內(nèi)酷胺的影響
[0042]
[0043] (3)最適攬拌轉(zhuǎn)速：50mL反應(yīng)體系中含有l(wèi)Og/L凍干細(xì)胞，底物濃度為50g/L，在 上述優(yōu)化的最適溫度和抑條件下，考察攬拌轉(zhuǎn)速對(duì)水解反應(yīng)的影響，轉(zhuǎn)速設(shè)定為200, 300 和40化/min。每隔一段時(shí)間取樣，進(jìn)行HPLC分析。經(jīng)確定，最適攬拌轉(zhuǎn)速為30化/min。
[0044] 表3攬拌轉(zhuǎn)速對(duì)重組枯草芽抱桿菌整細(xì)胞水解拆分丫 -內(nèi)酷胺的影響
[0045]
[0046] 實(shí)施例5 :利用重組枯草芽抱桿菌游離整細(xì)胞制備光學(xué)純（-)-丫-內(nèi)酷胺
[0047] 應(yīng)用上述優(yōu)選條件（pH9. 0,30°C，300;r/min)，在500血轉(zhuǎn)化體系中，分別利用 lOg/L和15g/L重組枯草芽抱桿菌凍干細(xì)胞，對(duì)lOOg/L丫-內(nèi)酷胺進(jìn)行拆分水解W制備光 學(xué)純（-)-丫-內(nèi)酷胺。最終，lOg/L催化劑添加條件下，反應(yīng)化，轉(zhuǎn)化率為55. 2%和ee為 98. 6% ;15g/L催化劑添加條件下，反應(yīng)地，轉(zhuǎn)化率為56. 3%的和ee為99. 2%。
[0048] 表4利用重組枯草芽抱桿菌游離整細(xì)胞放大制備光學(xué)純（-)-丫-內(nèi)酷胺
[0049]
[0050]實(shí)施例6 :利用重組枯草芽抱桿菌固定化細(xì)胞制備光學(xué)純（-)-丫-內(nèi)酷胺 [005。 應(yīng)用上述優(yōu)選條件（pH9. 0,30°(：，300以111111)，在500血轉(zhuǎn)化體系中，分別利用 lOg/L和15g/L重組枯草芽抱桿菌固定化細(xì)胞，對(duì)lOOg/L丫-內(nèi)酷胺進(jìn)行拆分水解W制備光 學(xué)純（-)-丫-內(nèi)酷胺。最終，在lOg/L催化劑添加條件下，反應(yīng)12h，轉(zhuǎn)化率為54. 5%和ee 為98. 7% ;在15g/L催化劑添加條件下，反應(yīng)lOh，轉(zhuǎn)化率為55. 6%和ee為99. 0%。
[0052] 表4利用重組枯草芽抱桿菌游離整細(xì)胞放大制備光學(xué)純（-)-丫-內(nèi)酷胺
[0053]
[0054] 實(shí)施例7 : -丫-內(nèi)酷胺產(chǎn)品分離提取
[0055] 對(duì)上述轉(zhuǎn)化反應(yīng)，利用等體積的二氯甲燒萃取反應(yīng)液=次，合并有機(jī)相，W無(wú)水硫 酸鋼干燥后，減壓蒸饋、干燥，得到產(chǎn)品（-)-丫-內(nèi)酷胺。經(jīng)檢測(cè)，（-)-丫-內(nèi)酷胺的光學(xué)純 度大于99 %，化學(xué)純度大于98 %。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一重組表達(dá)載體，其特征是：所述重組表達(dá)載體的骨架為PMA5,其包含有來(lái)源于 Delftiasp.CGMCC5755來(lái)源的（+)-y-內(nèi)酰胺酶基因，核苷酸序列如序列表中SEQIDNo. 1 所示，其編碼氨基酸序列如序列表中SEQIDNo. 2所示。2. -種重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，其特征在于：其包含如權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)載體或內(nèi) 酰胺酶基因。3. 如權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，其特征在于：其為將權(quán)利要求1所述的重組 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主微生物中制得的基因工程菌；所述的表達(dá)宿主為枯草芽孢桿菌，較佳 的為枯草芽抱桿菌（Bacillussubtilis) 168。4. 一種重組（+)-y-內(nèi)酰胺酶的制備方法，其特征在于包含如權(quán)利要求3所述的重組 表達(dá)轉(zhuǎn)化體，獲得重組（+)-T-內(nèi)酰胺酶。5. 如權(quán)利要求4所述的重組（+)-y-內(nèi)酰胺酶的制備方法，其特征在于其包括如下 步驟：將如權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體接種至培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)獲得種子液，將種 子液按2~5%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接至3L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，過(guò)程中控制溶氧不低于15%， pH在7.0左右，37°C培養(yǎng)12h后收集細(xì)胞，并冷凍干燥獲得重組（+)-y-內(nèi)酰胺酶；所述 的培養(yǎng)基包括：胰蛋白胨20g/L，酵母提取物16g/L，葡萄糖4g/L，NaC15g/L，Na2HP044g/L， KH2PO4O. 5g/L，（NH4)2S043g/L，pH為 7. 0〇6. -種產(chǎn)（+) _y-內(nèi)酰胺酶重組枯草芽孢桿菌的固定化方法，其特征在于將權(quán)利要求 5所述的重組轉(zhuǎn)化體進(jìn)行包埋固定化，獲得固定化催化劑。7. 如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于其包含如下步驟：將Ig凍干細(xì)胞充分溶 解于IOmL去離子水中，與40mL3%的海藻酸鈉溶液混合攪拌，通過(guò)注射器針頭將上述混合 液以5cm高度注入1 %的氯化鈣溶液中立即形成光滑的微球體，并將此固定化小球保持在 4°C的上述氯化鈣溶液中硬化30min，進(jìn)而在0. 3 %的戊二醛溶液中進(jìn)一步硬化，用生理鹽 水洗滌后將固定化細(xì)胞儲(chǔ)存在4°C冰箱中備用。8. 如權(quán)利要求5或7所述的固定化細(xì)胞作為催化劑在對(duì)映選擇性拆分Y-內(nèi)酰胺以制 備光學(xué)活性Y-內(nèi)酰胺中的應(yīng)用。9. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于：利用如權(quán)利要求5所述重組枯草芽孢桿菌 凍干細(xì)胞10~15g/L，催化水解100g/Ly-內(nèi)酰胺底物，反應(yīng)條件為溫度30°C;pH8~10， 優(yōu)選pH9. 0 ;攪拌轉(zhuǎn)速200~400rpm，優(yōu)選400rpm。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)過(guò)二氯甲烷萃取、減壓 蒸餾和干燥處理，最終獲得純度大于99%的（-)-y-內(nèi)酰胺。10. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于：利用如權(quán)利要求7所述的重組枯草芽孢 桿菌固定化細(xì)胞10~15g/L，水解100g/Ly-內(nèi)酰胺底物，反應(yīng)條件為溫度30°C，pH9. 0， 攪拌轉(zhuǎn)速300rpm，反應(yīng)結(jié)束后分離細(xì)胞，重新加入100g/LY-內(nèi)酰胺底物繼續(xù)反應(yīng)，連續(xù)操 作5批后合并反應(yīng)液，經(jīng)過(guò)二氯甲烷萃取、減壓蒸餾和干燥處理，最終獲得純度大于99%的 ㈠-丫-內(nèi)酰胺。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種應(yīng)用重組枯草芽孢桿菌全細(xì)胞催化生產(chǎn)光學(xué)純(-)-γ-內(nèi)酰胺的方法，屬于基因工程和生物工程領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建含有來(lái)源于Delftia？sp.CGMCC？5755的(+)-γ-內(nèi)酰胺酶基因的重組枯草芽孢桿菌B.subtilis？168/pMA5-delm，并表達(dá)產(chǎn)酶制備全細(xì)胞催化劑，對(duì)該重組全細(xì)胞進(jìn)行固定化，應(yīng)用該重組枯草芽孢桿菌到對(duì)映選擇性水解外消旋γ-內(nèi)酰胺，最終獲得光學(xué)純度大于99％的(-)-γ-內(nèi)酰胺。該微生物催化制備(-)-γ-內(nèi)酰胺的方法具有高立體選擇性、高反應(yīng)產(chǎn)率和高產(chǎn)物濃度的特點(diǎn)。CGMCC 575520120214
【IPC分類(lèi)】C12P41/00, C12N11/10, C12N9/86, C12N11/04, C12N1/21, C12N15/75, C12R1/125
【公開(kāi)號(hào)】CN105200076
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510612331
【發(fā)明人】倪曄, 韓瑞枝, 許國(guó)超, 董晉軍, 薛天云
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年12月30日
【申請(qǐng)日】2015年9月23日