%和49% ;032血清型的r巧基因比對(duì) 結(jié)果identity值和similarity值為23%和39% ;023血清型的wz;y基因比對(duì)結(jié)果identity 值和similarity值為69%和69%。所W各個(gè)血清型分別選取上述對(duì)應(yīng)的基因作為該血清型 的特異祀基因，針對(duì)各個(gè)血清型的基因特異區(qū)段分別設(shè)計(jì)特異引物。
[0027] 引物設(shè)計(jì)是該發(fā)明的核屯、部分。將上述基因?qū)隤rimer Premier 5進(jìn)行引物設(shè) 計(jì)，每個(gè)基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物，有單一目的條帶。
[002引引物設(shè)計(jì)之后在Genbank中進(jìn)行BLAST,設(shè)計(jì)的引物不能與其它近緣細(xì)菌的序列 相似性過(guò)高，運(yùn)樣就能確保該引物只在自己的預(yù)定位置進(jìn)行擴(kuò)增，而不與其它的近緣菌或 者采集標(biāo)本的環(huán)境中的近緣菌不產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)。運(yùn)一點(diǎn)對(duì)于避免非特異條帶的產(chǎn)生和實(shí)驗(yàn) 的成敗十分重要。
[0029] 設(shè)計(jì)出的引物如表1所示。
[0030] 表1用于PCR的引物序列
連施例4:特異引物的篩洗_ 收集了變形桿菌030、021、032及023血清型的標(biāo)準(zhǔn)菌株，4株桿菌屬其他菌株，1株克 雷伯菌屬菌株W及1株普羅威登斯菌菌株驗(yàn)證引物的特異性，菌株編號(hào)和來(lái)源見(jiàn)表2. 表2用于特異性檢測(cè)的菌株
基因鑒定引物篩選用到的PCR體系為5iiM引物0. 4y1、10X酶特異性反應(yīng)緩沖液 2. 5y1、lOmMdNTP0. 25y1、抓/y1耐熱DNA聚合酶0. 2y1及3y1的待測(cè)樣品模板到 0.2ml的薄壁PCR管中，最后(1地2〇補(bǔ)足到25iil。所有引物都在各自所對(duì)應(yīng)的血清型中得 到陽(yáng)性結(jié)果，在其他組中沒(méi)有得到任何PCR產(chǎn)物帶。
[0031] 運(yùn)個(gè)步驟中的PCR儀上的反應(yīng)循環(huán)參數(shù)包括DNA的變性、復(fù)性、延伸的溫度和時(shí) 間、循環(huán)次數(shù)，具體為： 前期為使變性能夠達(dá)到所需的溫度而必需的前期處理過(guò)程的一個(gè)循環(huán)為95°C，5分 鐘； 變性溫度和時(shí)間為95它，45秒； 復(fù)性溫度和時(shí)間為54°C/58°C，1分鐘； 延伸溫度和時(shí)間為72°C，1分鐘； 變性、復(fù)性、延伸的循環(huán)次數(shù)為35個(gè)循環(huán)； 為穩(wěn)定擴(kuò)增產(chǎn)物而進(jìn)行一個(gè)循環(huán)的溫度和時(shí)間為72°C，5分鐘 其中，047使用54°C擴(kuò)增，021使用58°C擴(kuò)增，032使用55-58°C擴(kuò)增，023使用54°C擴(kuò) 增。
[0032] 上述步驟在電泳設(shè)備中電泳擴(kuò)增產(chǎn)物，記錄結(jié)果的具體步驟為： 志取2~5y1擴(kuò)增產(chǎn)物與6X漠酪藍(lán)上樣緩沖液W1 :1的體積比混合； 雪將混合液上樣于1.5 %的瓊脂糖凝膠上； 惡將瓊脂糖凝膠電泳120V穩(wěn)壓電泳約20分鐘，用化2000Marker進(jìn)行對(duì)照； 宙觀(guān)察并記錄結(jié)果。
[0033] 通過(guò)基本PCR反應(yīng)之后引物篩選的工作基本結(jié)束，必要的長(zhǎng)度調(diào)整對(duì)整體反應(yīng)條 件影響不大，本發(fā)明中用到的引物序列全部總結(jié)在表1中。
[0034] 表1 用于PCR的引物序列
實(shí)施例5:PCR檢測(cè)試劑盒的制備及應(yīng)用 1、PCR試劑盒的組成： dNTP(lOmM) 30y1 ； 10XBuffer(10X酶特異性反應(yīng)緩沖液） 50y1 ; Taq聚合酶（5U/y1耐熱DM聚合酶） 5y1 ; PCR引物混合物（5yM) lOiil； 陽(yáng)性對(duì)照品化P) lOyl; 陰性對(duì)照品（KN) lOiil； dd&O 5ml; 每個(gè)試劑盒可用于檢測(cè)10個(gè)樣品（需要說(shuō)明的是：本專(zhuān)利中所有引物的混合均指檢測(cè) 某一特異血清型的上下游引物的混合。即P1與P2混合PCR出來(lái)的產(chǎn)物即為047.P3和P4 混合檢測(cè)的是021，P5和P6混合檢測(cè)出032,P7和P8混合檢測(cè)出023); 其中l(wèi)OXBuffer、dNTP、Taq聚合酶由寶生物工程有限公司提供；引物混合物為自行 設(shè)計(jì)的序列提供給上海英驗(yàn)生物技術(shù)公司合成；陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品和d地2〇由我們自 行制備。
[00巧]2、儀器設(shè)備 其中l(wèi)OXBuffer、dNTP、Taq聚合酶由上海生工提供；引物混合物為自行設(shè)計(jì)的序列 提供給上海英驗(yàn)生物技術(shù)公司合成；陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品和d地20由我們自行制備。 實(shí)驗(yàn)的設(shè)備PCR儀(又名DNA熱循環(huán)擴(kuò)增儀)、電泳設(shè)備(包括電泳儀及電泳槽)、凝膠成像 儀、-20°C冰箱、高速離屯、機(jī)、微量移液器和0. 2mlPCR薄壁管。
[0036] 3、PCR試劑盒的使用具體實(shí)例 使用上述的PCR試劑盒檢測(cè)變形桿菌的PCR檢測(cè)方法包括如下步驟： (1)提取待測(cè)環(huán)境樣品模板； (2 )在PCR薄壁管中加入、dNTP、10XBuffer、Taq聚合酶、引物、待測(cè)樣品模板和d地2〇 混勻； (3) 將薄壁PCR管中混勻的混合物在PCR儀上擴(kuò)增； (4) 在電泳設(shè)備中電泳擴(kuò)增產(chǎn)物，記錄結(jié)果； (5) 分析并進(jìn)行結(jié)果判斷。
[0037] 上述步驟（1)中的環(huán)境樣品模板為±壤、水、垃圾、腐敗有機(jī)物的粗提液，或是變 形桿菌的純培養(yǎng)物的粗提液或是純DNA，或是陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品。
[0038] 上述步驟（1)中的環(huán)境樣品模板的提取方法為： 定取1. 5ml培養(yǎng)物，在1200化pm條件下離屯、1分鐘，去掉上清液； 蠻取500y1的d地2〇重懸沉淀，在8000巧m條件下離屯、5分鐘，去掉上清液，烘干； 霞取100yId地2〇重懸沉淀，在100°C沸水中水浴10分鐘； 蛋再置于冰上10分鐘后，在1200化pm條件下離屯、2分鐘； ⑥取3y1中層上清作為PCR模板 上述步驟（3 )中的PCR儀上的反應(yīng)循環(huán)參數(shù)包括DNA的變性、復(fù)性、延伸的溫度和時(shí)間、 循環(huán)次數(shù)，具體為： 前期為使變性能夠達(dá)到所需的溫度而必需的前期處理過(guò)程的一個(gè)循環(huán)為95°C，5分 鐘； 變性溫度和時(shí)間為95°C，45秒； 復(fù)性溫度和時(shí)間為54°C/58°C，1分鐘； 延伸溫度和時(shí)間為72°C，1分鐘； 變性、復(fù)性、延伸的循環(huán)次數(shù)為35個(gè)循環(huán)； 為穩(wěn)定擴(kuò)增產(chǎn)物而進(jìn)行一個(gè)循環(huán)的溫度和時(shí)間為72°C，5分鐘。
[0039] 上述步驟（4)在電泳設(shè)備中電泳擴(kuò)增產(chǎn)物，記錄結(jié)果的具體步驟為： 變?nèi)?~5y1擴(kuò)增產(chǎn)物與6X漠酪藍(lán)上樣緩沖液W5 :1的體積比混合； 麵將混合液上樣于1.5%的瓊脂糖凝膠上； 讓將瓊脂糖凝膠電泳120V穩(wěn)壓電泳約20分鐘，用化2000Marker進(jìn)行對(duì)照； 雷觀(guān)察并記錄結(jié)果。
[0040] 本發(fā)明通過(guò)配置一種可檢測(cè)變形桿菌的可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的PCR試劑盒，將PCR檢測(cè) 方法需要使用的組分組合在一起，使用時(shí)，提取待測(cè)樣品，同時(shí)經(jīng)過(guò)較為簡(jiǎn)單的操作層序就 可W進(jìn)行快速、靈敏、簡(jiǎn)便的檢測(cè)，試劑盒中各組分的用量和濃度均為試驗(yàn)所得，用該試劑 盒檢測(cè)變形桿菌所使用的試驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)單，檢測(cè)成本低。
[0041] 使用陽(yáng)性和陰性對(duì)照品的目的是用于質(zhì)控整個(gè)操作過(guò)程，W便得出準(zhǔn)確的判斷。 若含有變形桿菌目的0抗原類(lèi)型，則從電泳結(jié)果中可W觀(guān)察到與陽(yáng)性對(duì)照品相同位置的條 帶；若不含有變形桿菌目的0抗原類(lèi)型，則與陰性對(duì)照品一樣不具有運(yùn)一條帶。
[0042] 本發(fā)明一次檢測(cè)試驗(yàn)所使用的試劑盒中的試劑量見(jiàn)下表3所示，DNA模板量為 3y 1 表3 -次檢測(cè)試驗(yàn)所使用的試劑盒中的試劑量
本發(fā)明中的耐熱DNA聚合酶為T(mén)aq酶。
[0043] 上述的陽(yáng)性對(duì)照品為已確定是變形桿菌各個(gè)0抗原類(lèi)型的樣品，陰性對(duì)照品則為 經(jīng)實(shí)驗(yàn)室確定不是變形桿菌的樣品。
[0044] 本PCR試劑盒若用變形桿菌的菌懸液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，與經(jīng)提取得到的DNA作為模 板所得結(jié)果一直。敏感度和特異性無(wú)差別，運(yùn)樣，可省去模板DNA的提取步驟，使操作方法 得W簡(jiǎn)化。同時(shí)，相比常規(guī)生化檢測(cè)方法而言，本方法所采用的待測(cè)樣品可W直接是臨床樣 品培養(yǎng)液，或者對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單分離培養(yǎng)就可W進(jìn)行檢測(cè)，因而節(jié)省了人力物力。
[0045] 4、待測(cè)樣品的提供 收集了變形桿菌047、021、032及023血清型標(biāo)準(zhǔn)菌株，4株桿菌屬其他菌株，1株克雷 伯菌屬菌株W及1株普羅威登斯菌菌株驗(yàn)證引物的特異性，菌株編號(hào)和來(lái)源見(jiàn)表2。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種對(duì)變形桿菌047, 021，032和023特異的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸為： SEQIDNO: 1-8所示的核苷酸中的至少一種。2. 權(quán)利要求1所述特異的核苷酸，其特征在于上述核苷酸可以用于制備檢測(cè)變形桿菌 用PCR試劑盒、基因芯片或微陣列；所述變形桿菌可以取樣于土壤、水、垃圾、腐敗有機(jī)物的 粗提液，或是變形桿菌的純培養(yǎng)物的粗提液。3. -種PCR試劑盒，包括PCR引物、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，所述PCR引物為如SEQ IDNO: 1-8所示的核苷酸中的至少一種。4. 權(quán)利要求3所述的試劑盒，還包括如下試劑：10 mM dNTP 30yl ;10X酶特異性反 應(yīng)緩沖液50 y I ;5U/ y 1耐熱DNA聚合酶5 y 1 ;引物混合物10 y 1 ;陽(yáng)性對(duì)照品10 y 1 ;陰 性對(duì)照品 IOy I ;ddH20 lml。5. 權(quán)利要求1所述對(duì)變形桿菌047, 021，032和023血清型特異的核苷酸在制備用于 檢測(cè)變形桿菌PCR試劑盒、檢測(cè)變形桿菌的基因芯片方面的應(yīng)用。6. 權(quán)利要求1所述對(duì)變形桿菌047, 021，032和023血清型特異的核苷酸在制備用于 檢測(cè)變形桿菌微陣列方面的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求5-6所述的應(yīng)用，其中所述的檢測(cè)變形桿菌指的是檢測(cè)引起食物中毒、尿 路感染、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、醫(yī)院內(nèi)感染多種混合型感染的細(xì)菌。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種對(duì)變形桿菌O47，O21，O32和O23特異的核苷酸及其應(yīng)用，所述核苷酸為SEQ？ID？NO:1-8所示的核苷酸中的至少一種。這些核苷酸可用于制備檢測(cè)變形桿菌用PCR試劑盒和基因芯片。本發(fā)明的對(duì)變形桿菌O抗原特異的核苷酸及包含該核苷酸的PCR試劑盒、基因芯片的實(shí)用性強(qiáng)，PCR試劑盒配制方法簡(jiǎn)便，檢測(cè)周期短、速度快，可操作性強(qiáng)，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，而檢測(cè)成本卻相對(duì)較低；準(zhǔn)確性高；靈敏度高。
【IPC分類(lèi)】C12Q1/04, C12Q1/68, C12N15/11
【公開(kāi)號(hào)】CN105200123
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510473568
【發(fā)明人】王磊, 張新杰, 許廣楠, 馮露, 王敏
【申請(qǐng)人】南開(kāi)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年12月30日
【申請(qǐng)日】2015年8月3日