與肝細胞生長因子結(jié)合的設(shè)計錨蛋白重復(fù)蛋白的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種對肝細胞生長因子（HGF)具有結(jié)合特異性的設(shè)計錨蛋白重復(fù)蛋 白，以及編碼該HGF結(jié)合蛋白的核酸，包含該蛋白的藥物組合物，以及該蛋白用于治療疾病 的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] MET原癌基因編碼受體酪氨酸激酶（MET或c-Met的），也稱為肝細胞生長因子受 體（HGFR ;人HGFR具有UniProtKB/SWISS-PROT編號P08581)，其對于胚胎發(fā)育和傷口愈合 必不可少。肝細胞生長因子（HGF，也稱為分散因子；人類HGF具有UniProtKB/SWISS-PROT 編號P14210)是c-Met的唯一已知配位體。該受體通常由上皮來源細胞表達，而HGF的表 達僅限于間質(zhì)來源的細胞。當受到HGF刺激時，c-Met誘發(fā)多種生物反應(yīng)，它們共同引發(fā) 被稱為浸潤性生長的程序。癌癥中的異常c-Met激活與不良預(yù)后具有相關(guān)性，其中異?；?性的c-Met觸發(fā)腫瘤生長，腫瘤細胞存活，血管生成和轉(zhuǎn)移。在許多類型的人惡性腫瘤中， c-Met失控，導致腎癌，肝癌，胃癌，乳房癌，腦癌，它同時也是抵抗其他靶向療法的主要因 ^ (Bottaro, D. P. , Rubin, J. S. , Faletto, D. L. , Chan, A. Μ. , Kmiecik, Τ. Ε. , Vande ffoude, G. F. and Aaronson, S. A. , Science 251 (4995), 802-804, 1991 ；Comoglio, Ρ. Μ, Giordano, S. and Trusolino, L. , Nat. Rev. Drug Discov. 7 (6), 504-516, 2008)〇
[0003] HGF被分泌為單個無活性單鏈前體多肽（SC-HGF，有時也稱為前-HGF)，并由絲氨 酸蛋白酶剪切為69kDa的α鏈和34kDa的β鏈。活性HGF是由所述α鏈和β鏈組成 的二硫鍵連接的異二聚體。HGF與凝血因子具有高度同源性，因為其α鏈包含了纖溶酶 原狀的"環(huán)形結(jié)構(gòu)域（Kringle) "結(jié)構(gòu)基序，并且所述β鏈包含絲氨酸蛋白酶的同源結(jié)構(gòu) 域，但缺乏酶活性（Naldini, L.，Weidner, Κ. Μ.，Vigna, Ε.，Gaudino, G.，Bardelli, A.，Ponz etto, C. , Narsimhan, R. P. , Hartmann, G. , Zarnegar, R. , Michalopoulos, G. K. , et al. , EMBO J. 10, 2867-2878, 1991) 〇
[0004] HGF通過與其受體結(jié)合，介導若干細胞反應(yīng)，包括各種細胞類型的分散，細管和腔 的形成，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變，血管生成，肝再生，傷口愈合和胚胎發(fā)育。HGF/c-Met的信號傳導 通路也已知在各種疾病中，包括許多人實體瘤中，參與腫瘤發(fā)展，侵襲和轉(zhuǎn)移。在人類癌癥 中，HGF對c-Met的旁分泌和自分泌的激活，這些分子在腫瘤中的表達，以及HGF流通濃度 升高的循環(huán)，均與預(yù)后不良相關(guān)聯(lián)，并增加腫瘤轉(zhuǎn)移的風險（Comoglio et al.，2008, Ioc. cit.) 〇
[0005] 由于HGF在癌癥和其他疾病的進程中的活躍作用，阻斷HGF活性的藥劑可以有利 于消除其影響。各種抗HGF(aHGF)的單克隆抗體（mAb)正在臨床開發(fā)中，包括AMG102(即 rilotumumab，一種來自安進（Amgen)公司的人源化抗人HGF IgG2)，來自先靈/樂聘 (Schering/Aveo)的 AV 299,和來自千年（Millennium)公司的 TAK-701。
[0006] 除抗體外，還有可用于特異性結(jié)合靶分子，由此充當拮抗劑的新型 結(jié)合蛋白或結(jié)合域（e. g. Binz, Η. K.，Amstutz, P. and PlUckthun, A.，Nat. Biotechnol. 23, 1257-1268, 2005)。此類不具有Fe的新型結(jié)合蛋白或結(jié)合域是基于設(shè)計 重復(fù)蛋白或設(shè)計重復(fù)域（冊2002/020565出11^，札1(.，厶1118七1^2，？.，1(〇111，厶.，5加11^^，]\1 T. , Briand, C. , Forrer, P. , Griltter, M. G. , and Plilckthun, A. , Nat. Biotechnol. 22, 575-582, 2004 ；Stumpp, M. T. , Binz, H. K and Amstutz, P. , Drug Discov. Today 13, 695-701，2008)。WO 2002/020565描述了如何構(gòu)建重復(fù)蛋白的大型文庫及其常見 應(yīng)用。然而，WO 2002/020565既沒有公開具有HGF結(jié)合特異性的重復(fù)域的篩選，也沒有公 開特異性結(jié)合HGF的重復(fù)域的具體重復(fù)模塊或重復(fù)序列基序。此外，WO 2002/020565沒有 暗示具有HGF結(jié)合特異性的重復(fù)域可以用來調(diào)節(jié)HGF介導的信號傳導通路，從而成功地治 療疾病。這些設(shè)計重復(fù)域利用重復(fù)蛋白的模塊化性質(zhì)，并且可以具有N端和C端加帽模塊， 以防止設(shè)計重復(fù)域通過屏蔽結(jié)構(gòu)域的疏水核心而聚集（Forrer, P.，Stumpp, Μ. T.，Binz, H. K. and Plilckthun, A. , FEBS letters 539, 2-6, 2003) 〇
[0007] 本發(fā)明解決的技術(shù)問題在于，鑒定具有HGF結(jié)合特異性的新型結(jié)合蛋白，例如錨 蛋白重復(fù)蛋白或結(jié)構(gòu)域，用于調(diào)節(jié)HGF介導的信號傳導通路，以改進對某些癌癥，血管疾 病，血管發(fā)生相關(guān)疾病和其他病理學病癥的治療。本發(fā)明通過提供權(quán)利要求中所表述的實 施方式來解決該技術(shù)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明涉及一種重組結(jié)合蛋白，包括至少一個錨蛋白重復(fù)域，其中所述錨蛋白重 復(fù)域與PBS (磷酸鹽緩沖液）中的HGF結(jié)合的Kd低于10 7M。
[0009] 更具體而言，本發(fā)明涉及一種重組結(jié)合蛋白，其包括至少一個錨蛋白重復(fù)域，所述 錨蛋白重復(fù)域與選自SEQ ID NOs: 33至61的錨蛋白重復(fù)域競爭與HGF的結(jié)合。
[0010] 本發(fā)明還涉及一種重組結(jié)合蛋白，其包括至少一個錨蛋白重復(fù)域，所述錨蛋白重 復(fù)域?qū)GF具有結(jié)合特異性，且包括錨蛋白重復(fù)模塊，該錨蛋白重復(fù)模塊具有選自SEQ ID N0:12至25的氨基酸序列以及如下序列：在該序列中，SEQ ID N0:12至25中的最多9個氨 基酸被任意氨基酸替代。
[0011] 特別地，本發(fā)明涉及一種重組結(jié)合蛋白，其包括至少一個錨蛋白重復(fù)域，所述錨蛋 白重復(fù)域包含至少一個與選自SEQ ID N0s:33至61的任一錨蛋白重復(fù)域具有至少90%氨 基酸序列一致性的氨基酸序列，其中所述錨蛋白重復(fù)域的位置1上的G和/或位置2上的 S可選缺失；且所述錨蛋白重復(fù)域的倒數(shù)第二個位置上的L和/或最后一個位置上的N可 選地替代為A。
[0012] 特別地，本發(fā)明涉及一種HGF結(jié)合重組蛋白，其包含序列SEQ ID NO: 1至25和33 至62中任一種肽。
[0013] 本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明所述的結(jié)合蛋白的核酸，且包含一種或多種上述結(jié)合蛋 白或核酸分子的藥物組合物。
[0014] 本發(fā)明還涉及一種使用本發(fā)明的結(jié)合蛋白治療病理癥狀的方法。
【附圖說明】
[0015] 圖1.選定DARPin的表面等離子體共振分析。
[0016] DARPin結(jié)合HGF的表面等離子體共振（SPR)分析（以DARPin#51為例）。各種濃 度（1.6, 3. 1，6. 3,12. 5和25nM)的DARPin被添加到固定有人HGF的流動池中120秒，接著 用緩沖液流洗。所得到的跡線在全局擬合后得到DARPin#51與人類HGF的相互作用的Kd 值為51PM。RU，共振單位；s，時間（秒）。請參閱下面對DARPin#51的定義。
[0017] RUjResonance Units ；s, time in seconds ；D1, DARPin#51 ；D2, DARPin#57 ； D3, DARPin#33. See below for the definition of DARPin#51, DARPin#57and DARPin#43.
[0018] 圖2.競爭表面等離子體共振分析。
[0019] 對 DARPin 結(jié)合人 HGF 的 SPR 分析（以 DARPin#51，DARPin#57 和 DARPin#43 為 例）。取IOOnM的DARPin#51 (即Dl)添加到固定有人HGF的流動池中120秒，接著注入第 二種 DARPin 100nm(DARPin#57 或 DARPin#33 ;即分別為 D2 或 D3)60 秒。因此，Dl 和 D3 競 爭結(jié)合HGF而Dl和D2不競爭結(jié)合HGF。
[0020] RU，共振單位；s，時間（秒）；Dl，DARPin#5l ;D2，DARPin#57 ;D3，DARPin#33。請參 閱下面對 DARPin#51，DARPin#57 和 DARPin#43 的定義。
[0021] 圖3.抑制HGF刺激的c-Met磷酸化
[0022] 如圖所示為，各種濃度的具有對人HGF(以DARPin#42和#48為例）特異性的 DARPin，在A549細胞中對HGF刺激的c-Met磷酸化的抑制作用，以及對應(yīng)的擬合抑制曲線 (以 DARPin#42 和 #48 為例）。測得 DARPin#42 和 #48 的 IC5。值分別為 0. 32 和 0.1 nM。
[0023] 0D，450-620nm 下的光密度；C，DARPin 濃度（nM) ;D1，DARPin#48 ;D2, DARPin#42 ; MA，最大激活；MI，最小激活。X軸所示為對數(shù)標度。請參閱下面對DARPin#52和DARPin#48 的定義。
[0024] 圖4.對U87細胞增殖的抑制。
[0025] 如圖所示為各種濃度的對HGF具有特異性抑制的DARPins對U87惡性膠質(zhì)瘤細胞 增殖的抑制和對應(yīng)的擬合抑制曲線（以DARPin#51和#43為例）。測得的DARPin#51和#43 的IC5。值分別為72和116nM。
[0026] 0D，450-620nm 下的光密度；C，DARPin 濃度（nM) ;DlDARPin#51 ;D2，DARPin#43。X 軸所示為在對數(shù)標度。請參閱下面對DARPin#51和DARPin#43的定義。
[0027] 圖5. c-Met克爭實驗。
[0028] 如圖所示為一個不同的單一實驗中，各種濃度的人HGF特異性DARPin對HGF與 c-Met結(jié)合的抑制和相應(yīng)的擬合抑制曲線。DARPin#43和#51的IC5。計算值分別為約1. 36 和0.6211]\1。00,450-62011111下的光密度；(：，0厶1?^11濃度（11]\1);01，0厶1?^11#51 ;02,0厶1?^11#43。 X軸所示為對數(shù)標度。請參閱下面對DARPin#51和43的定義。
[0029] 圖6.抗HGF DARPin vs.載體在U87腫瘤異種移植模型中的效力。
[0030] 將U87-MG腫瘤細胞皮下注射到裸鼠中。長有腫瘤動的物隨機分為4組，并用不同 濃度的聚乙二醇（PEG)化DARPin處理（每周靜脈注射三次，動物總共給藥七次）。PEG化 DARPin的生成如實施例6所述。
[0031] T，腫瘤體積（mm3) ;d，時間（天）；V，載體（即 PBS) ;D 1，PEG 化的 DARPin#62,每 次注射的劑量為0. llmg/kg ;D2，PEG化DARPin#62每次注射的劑量為I. lmg/kg ;D3，PEG化 DARPin#62每次注射的劑量為llmg/kg。
[0032] 圖7. SEQ ID NOs :12至28的多序列比對。SEQ ID NOS :12至28根據(jù)殘基位置對 齊進行多重序列比對。所述錨蛋白重復(fù)殘基位置編號表示在頂部。殘基位置2,5,7-13和 16-33對應(yīng)于通常含有骨架殘基的位置。殘基位置1，3,4,6,14和15對應(yīng)于其中可能包含 目標相互作用殘基的位置。
【具體實施方式】
[0033] 本發(fā)明所述的重組結(jié)合蛋白或結(jié)構(gòu)域具有哺乳類HGF特異性。優(yōu)選地，本發(fā)明所 述重組結(jié)合蛋白對小鼠、大鼠、犬、兔、猴或人源的HGF具有特異性。更優(yōu)選地，本發(fā)明所述 重組結(jié)合蛋白對人源的HGF具有特異性。
[0034] 術(shù)語"蛋白"指的是多肽，其中所述多肽至少部分具有確定的三維結(jié)構(gòu)，或能夠通 過在其多肽鏈之內(nèi)和/或之間形成二級，三級或四級結(jié)構(gòu)來取得確定的三維結(jié)構(gòu)。如果一 個蛋白包含兩種或更多種多肽，其個體多肽鏈可以非共價或共價連接，例如兩個多肽之間 形成二硫鍵。蛋白的部分，若能夠單獨具有，或能夠通過形成二級或三級結(jié)構(gòu)取得，確定的 三維結(jié)構(gòu)，則將其稱為"蛋白結(jié)構(gòu)域"。所述蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)域是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
[0035] 如在重組蛋白、重組蛋白結(jié)構(gòu)域、重組結(jié)合蛋白等中所用的術(shù)語"重組"，指的是， 所述多肽通過使用相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。例如，編碼多肽的重組 DNA分子（例如，通過基因合成產(chǎn)生）可以被克隆到細菌表達質(zhì)粒（如pQE30, Qiagen)，酵 母表達質(zhì)粒或哺乳動物表達質(zhì)粒中。例如，當所述構(gòu)建重組細菌表達質(zhì)粒插入到合適的細 菌（如大腸桿菌）中時，所述細菌可產(chǎn)生由該重組DNA編碼的多肽。相應(yīng)產(chǎn)生的多肽被稱 為重組多肽。
[0036] 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"多肽"涉及一種由一條或多條由多個（即兩個或更多 個）通過肽鍵連接的氨基酸組成的鏈組成。優(yōu)選地，多肽由通過肽鍵連接的八個以上氨基 酸組成。
[0037] 術(shù)語"多肽標記"指的是連接到多肽/蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列用 于所述多肽/蛋白的純化、檢測或靶定，或其中所述氨基酸序列增強所述多肽/蛋白的物 理化學行為，或其中所述氨基酸序列具有效應(yīng)子功能。結(jié)合蛋白的各多肽標記、部分和/或 結(jié)構(gòu)域可直接或通過多肽接頭彼此連接。這些多肽標記都是本領(lǐng)域熟知的，并且完全是本 領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的。多肽標記的例子包括小多肽序列，例如，組氨酸（His)(例如，所述 SEQ ID NO :9的His標記），原癌基因（myc)和FLAG，或鏈球菌（Str?。擞浕虿糠郑缑?(例如內(nèi)切酶樣堿性磷酸酶），其允許對所述多肽/蛋白或部分進行檢測，可用于靶向（如 免疫球蛋白或其片段）和/或作為效應(yīng)分子。
[0038] 術(shù)語"多肽接頭"是指一種氨基酸序列，其能夠連接，例如，兩個蛋白結(jié)構(gòu)域，多肽 標記和蛋白結(jié)構(gòu)域，蛋白結(jié)構(gòu)域和非多肽部分（如聚乙二醇）或兩個序列標記。所述附加 域、標記、非多肽部分和接頭是相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在專利申請WO 2002/020565的 說明書中提供了示例列表。此類接頭的具體例子包括可變長度的甘氨酸-絲氨酸接頭及 脯氨酸-蘇氨酸-接頭；優(yōu)選地，所述接頭的長度在2至24個氨基酸之間；更優(yōu)選地，所述 接頭的長度在2至16個氨基酸之間。甘氨酸-絲氨酸接頭的例子如SEQ ID NO: 10所示， 脯氨酸-蘇氨酸-接頭的例子如SEQ ID NO :11所示。優(yōu)選地，SEQ ID NO : 11所示的脯氨 酸-蘇氨酸-接頭之前和/或之后連接有GS。
[0039] 術(shù)語"聚合物部分"指的是蛋白聚合物部分或非蛋白聚合物部分。"蛋白聚合物部 分"優(yōu)選是不形成穩(wěn)定三級結(jié)構(gòu)的多肽。蛋白聚合物部分的例子包括XTEN? (Amunix的 注冊商標；WO 2007/10351)多肽，或如WO 2008/155134所述的包含脯氨酸、丙氨酸和絲氨 酸殘基的多肽。所述蛋白聚合物部分可以過使用標準DNA克隆技術(shù)產(chǎn)生基因融合多肽，隨 后通過標準的表達和純化，從而共價連接于例如本發(fā)明的結(jié)合域。"非蛋白聚合物部分"是 不由多肽構(gòu)建的聚合物部分。非蛋白聚合物部分的例子包括羥乙基淀粉（HES)，聚乙二醇 (PEG)，聚丙二醇，或聚氧化烯。術(shù)語"聚乙二醇化"（PEG化）是指PEG部分共價連接至，例 如，本發(fā)明的多肽。本發(fā)明的聚合物部分的分子量可以廣泛地變化。優(yōu)選地，所述聚合物部 分由多肽接頭連接至結(jié)合域。
[0040] 在一個具體實施例中，PEG部分或任何其它非蛋白聚合物可以，例如，通過馬來酰 亞胺接頭連接到半胱氨酸硫醇，其中該半胱氨酸經(jīng)由肽接頭與本文所述的結(jié)合域的N端或 C端結(jié)合。
[0041] 術(shù)語"結(jié)合蛋白"是指包含一個或多個結(jié)合域、一種或多種生物活性化合物和一種 或多種聚合物部分的蛋白，下文將進一步解釋。優(yōu)選地，所述結(jié)合蛋白包含最多四個結(jié)合 域。更優(yōu)選地，所述結(jié)合蛋白包含最多兩個結(jié)合域。最優(yōu)選地，所述結(jié)合蛋白只包含一個結(jié) 合域。此外，任何所述結(jié)合蛋白均可以包括不是結(jié)合域的附加蛋白結(jié)構(gòu)域、多聚化結(jié)構(gòu)部 分、多肽標記、多肽接頭和/或一個或多個Cys殘基。多聚化部分的示例包括配對提供功能 性免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)，以及亮氨酸拉鏈或多肽，其包括在兩個 所述多肽之間形成分子間二硫鍵的游離硫醇。Cys殘基可用于將其它部分連接到多肽上，例 如，通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的馬來酰亞胺化學。優(yōu)選地，所述結(jié)合蛋白是重組結(jié)合 蛋白。同樣優(yōu)選地，結(jié)合蛋白的結(jié)合域具有不同的靶向特異性。
[0042] 術(shù)語"生物活性化合物"指的是，當用于患有所述疾病的哺乳動物時，能夠進行疾 病調(diào)節(jié)的化合物。生物活性化合物可以具有拮抗性質(zhì)或激動性質(zhì)，并且可以是蛋白質(zhì)生物 活性化合物或非蛋白質(zhì)生物活性化合物。所述蛋白的生物活性化合物可以，例如，通過使 用標準DNA克隆技術(shù)產(chǎn)生基因融合多肽，隨后通過標準的表達和純化，從而共價連接于例 如本發(fā)明的結(jié)合域。可以通過化學方法，例如通過馬來酰亞胺接頭連接到半胱氨酸硫醇， 其中該半胱氨酸經(jīng)由肽接頭與本文所述的結(jié)合域的