用于鮑魚水產(chǎn)養(yǎng)殖的益生菌的生產(chǎn)的制作方法
【專利說明】用于鮑魚水產(chǎn)養(yǎng)殖的益生菌的生產(chǎn)
【背景技術(shù)】
[0001] 本發(fā)明涉及利用新型生物加工技術(shù)來生產(chǎn)用于鮑魚水產(chǎn)養(yǎng)殖的益生微生物的工 藝和培養(yǎng)基。
[0002] 目前并不存在生產(chǎn)鮑魚益生菌的生物工藝。本發(fā)明促進了如下的鮑魚益生菌的 生物生產(chǎn)：從細菌益生菌Vibrio midae、或酵母益生菌漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii)或者它們的組合的小體積低溫培養(yǎng)物生產(chǎn)益生菌產(chǎn)物。本發(fā)明描述了培養(yǎng)基、 接種程序、發(fā)酵工藝、生物質(zhì)收集以及將生物質(zhì)配制成可摻入到鮑魚飼料中的液體產(chǎn)品和/ 或干燥產(chǎn)品。
[0003] 鮑魚（鮑科（Haliotidae))是全球性地分布于沿海的溫帶和熱帶水域的海洋古腹 足類（vestigastropod)軟體動物（Degnan等，2006)。鮑科由約56個種組成，全部種均屬 于鮑屬（Haliotis)。鮑魚是世界上最有價值的海產(chǎn)品品種之一（Reddy-Lopata等，2006)， 在其已開發(fā)利用多年的遠東地區(qū)具有相當(dāng)大的需求量（Francis等，2007)。通常對鮑魚的 需求遠超過其供應(yīng)，由于非法采集和偷獵，給天然鮑魚的存量造成巨大壓力。某些大型鮑魚 的肉被許多人認為是理想的食品，并被認為是世界上最昂貴的蛋白產(chǎn)品之一。這種高價值 促進了密集型鮑魚水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展和優(yōu)化（Park等，2007)。然而，鮑魚水產(chǎn)養(yǎng)殖受到諸如 水質(zhì)差、此類海洋軟體動物固有的緩慢的生長速度和疾病等因素的挑戰(zhàn)。
[0004] 鮑魚水產(chǎn)養(yǎng)殖的成功依賴于適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)和疾病的消除（Naidoo等，2006)。該問題 的傳統(tǒng)解決方案是在鮑魚的水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用抗微生物藥物，然而該方式會導(dǎo)致抗生素耐藥 性細菌的發(fā)展（Schwarz等，2001)，對環(huán)境和鮑魚養(yǎng)殖造成負面影響，同時造成消費者的抵 制。Macey和Coyne (2006)提出補充有益生菌的飼料改善了鮑魚的免疫系統(tǒng)和生長。
[0005] 鮑魚具有極其緩慢的生長速度，需要花費近四年來達到市場可接受的尺寸。因此， 迫切需要研究加快鮑魚的生長速度并提高其疾病耐受性的方法。
[0006] 對于鮑魚養(yǎng)殖業(yè)面臨的挑戰(zhàn)，可選的方式是使用益生微生物。由于對環(huán)境友好型 水產(chǎn)養(yǎng)殖需求的增加，該技術(shù)變得普及。益生菌是活的微生物，在以適當(dāng)量給予時賦予宿主 以保健效應(yīng)。它們顯示出控制疾病、改善消化以及提高養(yǎng)殖品種的免疫力和整體生長。
[0007] Macey和Coyne (2006)從作為鮑魚的南非鮑（Haliotis midae)的胃腸道中分離 出Vibrio midae和漢遜德巴利酵母，并對益生菌活性、特別是提高鮑魚生長速度的能力進 行了評價。Macey和Coyne (2005)進行的研究顯示，對鮑魚飼料補充這些益生微生物產(chǎn)生改 善的生長速度。益生微生物能夠分解存在于天然海藻（鮑魚食料）中的復(fù)雜多糖和蛋白并 且能夠增高消化效率，由此改善鮑魚的生長速度（Coyne等，2004)。這些微生物提高了鮑魚 腸內(nèi)的一些活性，如噬菌作用活性、蛋白酶活性和淀粉酶活性。
[0008]目前的技術(shù)描述了天然存在的細菌和酵母在水產(chǎn)養(yǎng)殖中作為益生菌的用途。在這 方面，現(xiàn)有技術(shù)公開了來自弧菌科（vibrionaceae)的細菌在對奸（Ruangpan等，1998)和褐 奸（Austin等，1995)的水產(chǎn)養(yǎng)殖中作為益生菌的用途。Nair等，1985 ;Carraturo等，2006 和Castro等，2006報道了從海洋環(huán)境中分離的其它弧菌種也顯示出益生菌效果。
[0009]南非專利 2004/06777 以及 Macey 和 Coyne (2005, 2006)進行的工作描述了 Vibrio midae和漢遜德巴利酵母在鮑魚的水產(chǎn)養(yǎng)殖中作為益生菌的用途。該工作的主要部分中，在 22°C下于海洋肉湯（MB)中培養(yǎng)Vibrio midae，在22°C下于酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖肉 湯（YPD)培養(yǎng)基中培養(yǎng)漢遜德巴利酵母。Macey和Coyne進行的工作并未研究最佳培養(yǎng)條 件、細胞培養(yǎng)物濃度，并未測量培養(yǎng)物的光密度和/或測量生物質(zhì)的生產(chǎn)。對Macey和Coyne 使用的工藝和生產(chǎn)培養(yǎng)基與本發(fā)明的工藝和生產(chǎn)培養(yǎng)基進行的比較性評價表明，與現(xiàn)有技 術(shù)中關(guān)于Vibrio midae和漢遜德巴利酵母的描述相比，本發(fā)明人能夠?qū)ibrio midae和 漢遜德巴利酵母的細胞產(chǎn)率顯著提高多個數(shù)量級（參見實施例3)。
[0010] 漢遜德巴利酵母通常用作工業(yè)酵母。之前對該酵母進行的研究一般并未關(guān)注將其 作為全細胞生物催化劑的用途，而是關(guān)注該酵母在代謝產(chǎn)物（如甘油和木糖）生產(chǎn)中用途 (Adler 和 Gustafsson，1980 ;Parajo 等，1997)。
[0011] 然而，現(xiàn)有技術(shù)將漢遜德巴利酵母描述為水生物種（例如，鱸魚（Tovar等，2002) 和虹鱒魚（Andlid等，1995))的微生物群中的一員。在這些研究中，同樣在酵母提取物-蛋 白胨-葡萄糖肉湯（YPD)中培養(yǎng)漢遜德巴利酵母，并且這些研究均未對最佳培養(yǎng)條件、細胞 培養(yǎng)濃度、光密度或生物質(zhì)生產(chǎn)進行研究。
[0012] 本申請文件描述了用于培養(yǎng)Vibrio midae和漢遜德巴利酵母的新型高產(chǎn)率生物 工藝以及Vibrio midae和漢遜德巴利酵母在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的用途。該領(lǐng)域中此前的工作并 沒有提供用于鮑魚益生菌的大規(guī)模生產(chǎn)的工藝。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)益生菌飼料組合物的新型工藝，其中，所述益生菌飼料組 合物包含Vibrio midae的活的培養(yǎng)物和/或漢遜德巴利酵母細胞的活的培養(yǎng)物和/或所 述活的培養(yǎng)物的組合。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了用于培養(yǎng)益生菌的生長培養(yǎng)基，所述益生菌用于 生產(chǎn)鮑魚的益生菌組合物和益生菌飼料。
[0015] 在本發(fā)明的一個實施方式中，生長培養(yǎng)基是細菌生長培養(yǎng)基，所述細菌生長培養(yǎng) 基包含：檸檬酸、Η3Ρ04、約 Og/Ι-約 4g/l (NH4) 2S04、Ca (NO3) 2、MnSO4 · 7H20、FeSO4 · 7H20、KCl、 約 20g/l_ 約 40g/l NaCUMgCl2 ·6Η20、約 42g/l_ 約 255g/l 玉米衆(zhòng)、約 lg/l_ 約 40g/l 轉(zhuǎn)化 的高級糖蜜（inverted high test molasses)、以及約0.5ml/l_約5ml/l消泡劑；該生長培 養(yǎng)基的pH為約5-約8。優(yōu)選的是，細菌生長培養(yǎng)基包含約lg/Ι檸檬酸、約2.5ml/l Η3Ρ04、 約0.48/10&(勵3)2、約0.04(^/1]\11150 4.7!120、約 0.0328/1?6504.7!120、約18/11((：1、約 30g/l NaCl、約2. 3g/l MgCl2 · 6H20、約54. 4g/l玉米漿、約24g/l轉(zhuǎn)化的高級糖蜜、以及約 lml/Ι消泡劑；其中，該生長培養(yǎng)基的pH維持在約6. 5。與海洋肉湯（MB)培養(yǎng)基相比，該細 菌生長培養(yǎng)基支持顯著更高的Vibrio midae的細胞產(chǎn)率（g/1/h)。
[0016] 在本發(fā)明的另一實施方式中，生長培養(yǎng)基是酵母生長培養(yǎng)基，所述酵母生長培養(yǎng) 基包含：檸檬酸、Η3Ρ04、約 18g/l-約 30g/l (NH4)2S04、MgS04 WH2SO4XaCl2 ·2Η20、約 Og/Ι-約 40g/l NaCl、KH2PO4、約8g/l-約212g/l玉米漿、約lg/1-約40g/l轉(zhuǎn)化的高級糖蜜、以及 約0. 5ml/l-約5ml/l消泡劑；該生長培養(yǎng)基的pH為約4-約7。優(yōu)選的是，酵母生長培養(yǎng) 基包含約 2. 5g/l 檸檬酸、約 16. 3ml/l Η3Ρ04、約 30g/l (NH4)2S04、約 8. 2g/l MgSO4 · 7H2S04、 約 0· 8g/l CaCl2 ·2Η20、約 0· lg/1 NaCl、約 11. 3g/l KH2P04、約 204g/l 玉米漿、約 10g/l 葡 萄糖、以及約lml/1消泡劑；其中，該生長培養(yǎng)基的pH維持在約5. 6。與酵母提取物-蛋白 胨-葡萄糖（YPD)培養(yǎng)基相比，該酵母生長培養(yǎng)基支持顯著更高的漢遜德巴利酵母的細胞 產(chǎn)率（g/1/h)。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了用于生產(chǎn)益生菌組合物的工藝，其中，所述工藝包 括如下步驟：（i)通過將活的Vibrio midae細胞和/或活的漢遜德巴利酵母細胞的培養(yǎng)物 接種至接種物培養(yǎng)基，制備預(yù)發(fā)酵培養(yǎng)物；（ii)將預(yù)發(fā)酵培養(yǎng)物接種至反應(yīng)器中含有的生 長培養(yǎng)基；（iii)在Vibrio midae細胞和/或漢遜德巴利酵母細胞的生長期期間，控制生長 培養(yǎng)基的PH、溫度、氣流量、氧飽和度以及背壓；（iv)在對數(shù)生長中期和穩(wěn)定生長期之間， 當(dāng)細胞處于穩(wěn)定形式且活細胞的濃度為2 X IO8個細胞/ml至I X 10 11個細胞/ml時，收集 Vibrio midae細胞；或者，在對數(shù)生長中期和對數(shù)生長晚期之間，當(dāng)活細胞的濃度為4X IO7個細胞/ml至2X 101°個細胞/ml時，收集漢遜德巴利酵母細胞；以及（V)通過將收集的 Vibrio midae細胞和/或漢遜德巴利酵母細胞重懸于緩沖液中，生產(chǎn)液體產(chǎn)品。
[0018] 本申請文件中描述的分離的Vibrio midae于2013年7月1月保藏在Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)，保藏編號為LMG P-27727。同樣，本 申請文件描述的分離的漢遜德巴利酵母培養(yǎng)物于2013年7月1日保藏，保藏編號為MUCL 54982〇
[0019] 所述工藝可進一步包括如下步驟：(vi)將液體產(chǎn)品與載體、穩(wěn)定劑或填料進行混 合，以形成生物質(zhì)糊狀物；以及（vii)將生物質(zhì)糊狀物進行干燥，以生產(chǎn)干燥產(chǎn)品。
[0020] 本發(fā)明的工藝可為間歇工藝或間歇補料工藝。優(yōu)選的是，對于Vibrio midae而言， 所述工藝為間歇工藝；對于漢遜德巴利酵母而言，所述工藝為間歇補料工藝。
[0021] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，進入用于間歇補料工藝或間歇工藝的反應(yīng)器中的氣 流量為〇. 5v/v/m-2. Οv/v/m。優(yōu)選的是，進入反應(yīng)器中的氣流量為lv/v/m。
[0022] 在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方式中，發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶解氧優(yōu)選處于 20% -100%的飽和度。更優(yōu)選的是，溶解氧維持在30%的飽和度。
[0023] 在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方式中，反應(yīng)器中的背壓優(yōu)選為0_250kPa。更優(yōu)選的 是，反應(yīng)器中的背壓為50kPa。
[0024] 優(yōu)選將Vibrio midae細胞在20°C-34°C的溫度下于培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。最優(yōu)選 將Vibrio midae細胞在30°C的溫度下進行培養(yǎng)。另一方面，優(yōu)選將漢遜德巴利酵母細胞在 16°C _34°C的溫度下于培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。最優(yōu)選將漢遜德巴利酵母細胞在24°C的溫度下 進行培養(yǎng)。
[0025] Vibrio midae的培養(yǎng)基的pH優(yōu)選為5. 0-8. 0,最優(yōu)選該pH為6. 5。漢遜德巴利酵 母的培養(yǎng)基的pH優(yōu)選為4. 0-7. 0,最優(yōu)選該pH為5. 6。
[0026] 應(yīng)理解的是，本發(fā)明工藝中使用的生長培養(yǎng)基包含用于Vibrio midae和/或漢遜 德巴利酵母細胞生長的營養(yǎng)物。所述營養(yǎng)物選自于由無機鹽、碳源、氮源、維生素、微量元 素、消泡劑和上述物質(zhì)的混合物所組成的組。此外，應(yīng)理解的是，接種物培養(yǎng)基包含用于本 發(fā)明工藝中使用的益生菌的生長的營養(yǎng)物，所述營養(yǎng)物選自于由如下物質(zhì)所組成的組：無 機鹽、碳源、氮源、維生素、微量元素和上述物質(zhì)的混合物。
[0027] 在本發(fā)明的一個實施方式中，通過離心或過濾從生長培養(yǎng)基中收集益生微生物。 在優(yōu)選的實施方式中，通過垂直管離心收集益生微生物。
[0028] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，將益生微生物Vibrio midae重懸于磷酸鹽緩沖液 中，從而生成液體產(chǎn)品。類似地，將益生微生物漢遜德巴利酵母重懸于磷酸鹽緩沖液中，從 而生成液體產(chǎn)品；優(yōu)選磷酸鹽緩沖液包含約4m/m% -20m/m%海藻糖、優(yōu)選12. 5m/m%海藻 糖；該緩沖液的pH為約4-6,優(yōu)選該pH為4. 5。
[0029] 在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方式中，將液體產(chǎn)品與載體進行組合以形成混合產(chǎn) 品，所述載體選自于由微晶纖維素、海藻糖、蔗糖和脫脂奶或它們的組合所組成的組。在另 一優(yōu)選的實施方式中，將生物質(zhì)糊狀物擠出并干燥，從而形成干燥產(chǎn)品。
[0030] 通常在30°C _70°C的溫度下對與載體組合的Vibrio midae液體產(chǎn)品進行擠出，然 而優(yōu)選在45°C的溫度下進行擠出。通常在30°C _50°C的溫度下對與載體組合的漢遜德巴利 酵母液體產(chǎn)品進行擠出，然而優(yōu)選在45°C的溫度下進行擠出。