在DNA剪切和隨后ChIP步驟期間的DNA損失。如果DNA在任何步驟永久損失，則即使更佳的無偏向DNA擴(kuò)增也不可用。因此，需要發(fā)展出一套技術(shù)，從而允許從ChIP中進(jìn)行有效DNA回收以允許在小數(shù)量的細(xì)胞中進(jìn)行有效的基因組測(cè)序。
[0061]染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)
[0062]ChIP的原理基礎(chǔ)在于，在活細(xì)胞內(nèi)封裝DNA的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物(S卩，染色質(zhì))可以經(jīng)制備而保持表征各個(gè)活細(xì)胞的特異性的DNA-蛋白質(zhì)互相作用。這些染色質(zhì)(S卩，蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物)片段隨后可使用針對(duì)所討論蛋白質(zhì)的抗體來進(jìn)行免疫沉淀。分離的染色質(zhì)部分可隨后進(jìn)行處理以分離DNA和蛋白質(zhì)組分，并且可隨后通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或用于鑒別所定義序列的DNA片段的其他技術(shù)，確定結(jié)合具體蛋白質(zhì)來分離的DNA片段(即，用于免疫沉淀法的抗體所針對(duì)的所述蛋白質(zhì))的同一性。
[0063]ChIP 一般涉及以下三個(gè)關(guān)鍵步驟:一(i)從細(xì)胞中分離待分析的染色質(zhì)；(ii)使用抗體對(duì)染色質(zhì)進(jìn)行免疫沉淀法；以及(iii)DNA分析。雖然熟練技術(shù)人員將了解存在各種用于執(zhí)行ChIP的方法，但以下實(shí)例是ChIP所基于的標(biāo)準(zhǔn)原理的總體概述。
[0064]ChIP 一般包括從細(xì)胞的生物樣本中分離染色質(zhì)的步驟。一旦采集到細(xì)胞，則提取其細(xì)胞核。在細(xì)胞核釋放之后，將所述細(xì)胞核消化以便釋放染色質(zhì)。在其中所述方法包括使用NChIP(如下所述)的實(shí)施方案中，通過標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)?xì)胞核進(jìn)行核酸酶消化，分離出染色質(zhì)。例如，可在消化時(shí)添加微球菌核酸酶。在其中所述方法包括使用XChIP(如下所述)的實(shí)施方案中，將染色質(zhì)交聯(lián)。例如，可通過添加諸如甲醛的合適交聯(lián)劑來使染色質(zhì)交聯(lián)。此后，使染色質(zhì)斷裂?？赏ㄟ^超聲處理來進(jìn)行斷裂。然而，可在斷裂之后添加甲醛，然后繼以核酸酶消化?；蛘?，UV輻射可用作替代性交聯(lián)技術(shù)。
[0065]在斷裂和交聯(lián)之后，使蛋白質(zhì)固定在染色質(zhì)上，并且可對(duì)蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物進(jìn)行免疫沉淀。因此，一旦染色質(zhì)已分離，則該方法包括使染色質(zhì)免疫沉淀的步驟。用于免疫沉淀法步驟的合適技術(shù)也將是熟練技術(shù)人員已知的，并且實(shí)施例描述一種可如何實(shí)現(xiàn)此舉的方法?？稍谔砑俞槍?duì)所討論蛋白質(zhì)的合適抗體之后，進(jìn)行免疫沉淀法。應(yīng)可理解的是，合適抗體將取決于何種類型的表觀遺傳分析正在進(jìn)行(即，正在受分析的基因表達(dá))。
[0066]表觀遺傳分析是研究往往導(dǎo)致基因表達(dá)或沉默的細(xì)胞DNA的各種改變(稱為表觀遺傳標(biāo)志)ο應(yīng)該了解，根據(jù)本發(fā)明的方法可用于在任何所關(guān)注細(xì)胞類型的基因組的任何基因或區(qū)域上分析任何類別的表觀遺傳性修飾。樣本中的DNA修飾可導(dǎo)致的表觀遺傳標(biāo)志的實(shí)例包括組蛋白蛋白質(zhì)修飾、非組蛋白蛋白質(zhì)修飾和DNA甲基化。
[0067]因此，舉例而言，用于免疫沉淀法步驟的抗體可能對(duì)諸如轉(zhuǎn)錄因子的非組蛋白蛋白質(zhì)、或其他DNA結(jié)合蛋白是免疫特異性的?；蛘撸e例而言，該抗體可能對(duì)組蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4中的任一者以及它們的各種翻譯后修飾同種型和變體(例如H2AZ)是免疫特異性的。或者，舉例而言，該抗體可能對(duì)涉及染色質(zhì)修飾的酶是免疫特異性的，所述酶諸如為組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶或脫乙?；?、或DNA甲基移換酶。此外，組蛋白可通過所定義的酶，通過諸如乙?；?、甲基化、磷酸化、ADP核糖化、SUMO化修飾和泛素化，而在活體內(nèi)被翻譯后修飾。因此，該抗體可能對(duì)這些翻譯后修飾中的任一者皆為免疫特異性的。
[0068]在免疫沉淀法步驟之后，該方法一般包括使來自分離蛋白/DNA部分的DNA純化的步驟。此舉可諸如通過苯酚-氯仿提取的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他純化法來實(shí)現(xiàn)。
[0069]在純化步驟之后，通過PCR來分析結(jié)合蛋白質(zhì)所分離的DNA片段。例如，該分析步驟可包括使用合適引物，所述引物在PCR期間將導(dǎo)致一段核酸的擴(kuò)增。熟練技術(shù)人員將了解，根據(jù)本發(fā)明的方法可被用于在特異性PCR引物制備所針對(duì)的基因組的任何基因或任何區(qū)域上分析表觀遺傳性修飾。
[0070]ChIP技術(shù)具有兩種主要變型，這些變型主要在起始(輸入)染色質(zhì)如何制備方面有所不同。第一變型(稱為NChIP)使用通過標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)?xì)胞核進(jìn)行微球菌核酸酶消化所制備的天然染色質(zhì)。然而，NChIP不可用于分析非組蛋白蛋白質(zhì)，因?yàn)檫x擇性核酸酶消化可能偏向輸入染色質(zhì)，并且核小體在消化期間可能重排。
[0071]第二變型(稱為XChIP)使用通過在斷裂染色質(zhì)(例如，通過超聲處理進(jìn)行斷裂)之前添加甲醛以使細(xì)胞生長(zhǎng)來進(jìn)行了交聯(lián)的染色質(zhì)。作為甲醛的替代形式，已成功使用UV輻射作為替代性交聯(lián)技術(shù)。然而，XChIP常常低效，并且可能產(chǎn)生錯(cuò)誤結(jié)果。例如，XChIP交聯(lián)可能固定(并進(jìn)而擴(kuò)大)蛋白質(zhì)和基因組DNA之間的瞬態(tài)互相作用。此外，在XChIP中，抗體特異性可能因其所識(shí)別的蛋白質(zhì)中的化學(xué)變化(由交聯(lián)程序所引發(fā))而受到損害。
[0072]此外，NChIP和XChIP的主要問題在于，它們兩者皆需要至少16個(gè)細(xì)胞才能夠產(chǎn)生足夠數(shù)量的染色質(zhì)以用于技術(shù)操作(Nature Genetics，2005，37，1194-1200)。如此大量的細(xì)胞可用培養(yǎng)細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)，但采用來自低數(shù)量細(xì)胞源，例如具有包含少于60個(gè)細(xì)胞(人類)或20個(gè)細(xì)胞(小鼠)的典型ICM的早期胚胎，是不可能實(shí)現(xiàn)的。對(duì)于這一關(guān)鍵原因，ChIP和ChlP-seq限于大細(xì)胞群體的樣本，進(jìn)而妨礙對(duì)尚未培養(yǎng)或永生化的初級(jí)細(xì)胞的廣泛表觀遺傳分析。因此，因?yàn)楸碛^遺傳改變響應(yīng)于環(huán)境影響而發(fā)生，所以不可能使用培養(yǎng)細(xì)胞(活體外)來研究在活體內(nèi)驅(qū)動(dòng)分化和細(xì)胞改變的表觀遺傳機(jī)制。真實(shí)理解細(xì)胞在有機(jī)體內(nèi)其自然狀態(tài)時(shí)的表觀遺傳性狀態(tài)的唯一方式是研究從有機(jī)體中直接提取(活檢)的細(xì)胞，并且使細(xì)胞不暴露于體外培養(yǎng)中的人工條件(即，在體外培養(yǎng)中使小數(shù)量的初級(jí)細(xì)胞繁殖到至少16個(gè)細(xì)胞)，所述人工條件可能導(dǎo)致表觀遺傳性修飾。
[0073]在ChIP期間，存在DNA損失的三個(gè)主要來源:超聲處理、免疫沉淀法和從小珠上洗提ChIP DNA。為保護(hù)所關(guān)注DNA以免損失，重要的是添加載體DNA，所述載體DNA可通過ChIP的連續(xù)步驟與所關(guān)注DNA —起受到處理。
[0074]在某些實(shí)施方案中，本文所述的本發(fā)明包括一種添加生物素化的方法，所述載體DNA在ChIP期間用所關(guān)注DNA進(jìn)行處理以防止所關(guān)注DNA損失。如本文所用，防止所關(guān)注DNA損失和增加所關(guān)注DNA回收的方法稱為“經(jīng)由保護(hù)來回收”或“RePro”或“ReProChIP-Seq'圖1中提供RePro的圖式。
[0075]可通過將來自具有小數(shù)量所關(guān)注細(xì)胞的不同物種的大數(shù)量交聯(lián)細(xì)胞混合，而執(zhí)行RePro0在某些實(shí)施方案中，來自不同物種的細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如人類細(xì)胞、小鼠細(xì)胞、大鼠細(xì)胞、倉鼠細(xì)胞、貓科動(dòng)物細(xì)胞、犬科動(dòng)物細(xì)胞和靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞)、昆蟲細(xì)胞(例如果蠅細(xì)胞)、細(xì)菌細(xì)胞(例如大腸桿菌細(xì)胞)、或酵母細(xì)胞(例如啤酒酵母)(圖2)。
[0076]在特定實(shí)施方案中，在果蠅、小鼠、或人類細(xì)胞的RePro中可將大腸桿菌細(xì)胞用作來自不同物種的細(xì)胞。在特定實(shí)施方案中，在果蠅、小鼠、或人類細(xì)胞的RePro中可將啤酒酵母細(xì)胞用作來自不同物種的細(xì)胞。
[0077]在一個(gè)特定實(shí)施方案中，使用酵母細(xì)胞來對(duì)組蛋白H3賴氨酸4甲基化或賴氨酸9甲基化(分別為H3K4me或H3K9me)進(jìn)行表觀遺傳分析，因?yàn)榭墒褂孟嗤贵w來對(duì)在酵母、果蠅、小鼠和人類中顯示這些表觀遺傳修飾組蛋白標(biāo)志的染色質(zhì)進(jìn)行ChIP。
[0078]分析物生物樣本
[0079]在某些實(shí)施方案中，本文所述方法包括使用少于一百萬個(gè)細(xì)胞、少于900，000個(gè)細(xì)胞、少于800，000個(gè)細(xì)胞、少于700，000個(gè)細(xì)胞、少于600，000個(gè)細(xì)胞、少于500，000個(gè)細(xì)胞、少于400，000個(gè)細(xì)胞、少于300，000個(gè)細(xì)胞、少于200，000個(gè)細(xì)胞、少于90，000個(gè)細(xì)胞、少于80，000個(gè)細(xì)胞、少于70，000個(gè)細(xì)胞、少于60，000個(gè)細(xì)胞、少于50，000個(gè)細(xì)胞、少于40，000個(gè)細(xì)胞、少于30，000個(gè)細(xì)胞、少于20，000個(gè)細(xì)胞、或少于10，000個(gè)細(xì)胞作為分析物生物樣本來進(jìn)行ChlP-seq。
[0080]在某些實(shí)施方案中，本文所述方法包括使用約20，000個(gè)細(xì)胞、約19，000個(gè)細(xì)胞、約18，000個(gè)細(xì)胞、約17，000個(gè)細(xì)胞、約16，000個(gè)細(xì)胞、約15，000個(gè)細(xì)胞、約14，000個(gè)細(xì)胞、約13，000個(gè)細(xì)胞、約12，000個(gè)細(xì)胞、約11，000個(gè)細(xì)胞、約10，000個(gè)細(xì)胞、約9，500個(gè)細(xì)胞、約9，000個(gè)細(xì)胞、約8，500個(gè)細(xì)胞、約7，500個(gè)細(xì)胞、約7，000個(gè)細(xì)胞、約6，500個(gè)細(xì)胞、約6，000個(gè)細(xì)胞、約5，500個(gè)細(xì)胞、約5，000個(gè)細(xì)胞、約4，500個(gè)細(xì)胞、約4，000個(gè)細(xì)胞、約3，500個(gè)細(xì)胞、約3，000個(gè)細(xì)胞、約2，500個(gè)細(xì)胞、約2，000個(gè)細(xì)胞、約1，900個(gè)細(xì)胞、約1，800個(gè)細(xì)胞、約1，700個(gè)細(xì)胞、約1，600個(gè)細(xì)胞、約1，500個(gè)細(xì)胞、約1，400個(gè)細(xì)胞、約I, 300個(gè)細(xì)胞、約1，200個(gè)細(xì)胞、約1，100個(gè)細(xì)胞、約1,000個(gè)細(xì)胞、約950個(gè)細(xì)胞、約900個(gè)細(xì)胞、約850個(gè)細(xì)胞、約800個(gè)細(xì)胞、約750個(gè)細(xì)胞、約700個(gè)細(xì)胞、約650個(gè)細(xì)胞、約600個(gè)細(xì)胞、約550個(gè)細(xì)胞、約500個(gè)細(xì)胞、約450個(gè)細(xì)胞、約400個(gè)細(xì)胞、約350個(gè)細(xì)胞、約300個(gè)細(xì)胞、約250個(gè)細(xì)胞、約200個(gè)細(xì)胞、約150個(gè)細(xì)胞、約100個(gè)細(xì)胞、約90個(gè)細(xì)胞、約80個(gè)細(xì)胞、約70個(gè)細(xì)胞、約60個(gè)細(xì)胞、約50個(gè)細(xì)胞、約40個(gè)細(xì)胞、約35個(gè)細(xì)胞、約30個(gè)細(xì)胞、約25個(gè)細(xì)胞、約20個(gè)細(xì)胞、約15個(gè)細(xì)胞、約10個(gè)細(xì)胞、9個(gè)細(xì)胞、8個(gè)細(xì)胞、7個(gè)細(xì)胞、6個(gè)細(xì)胞、5個(gè)細(xì)胞、4個(gè)細(xì)胞、3個(gè)細(xì)胞、2個(gè)細(xì)胞、或I個(gè)細(xì)胞作為分析物生物樣本來進(jìn)行ChlP-seq。
[0081]在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，該方法包括在作為分析物生物樣本的少于5，000個(gè)細(xì)胞、少于1，000個(gè)細(xì)胞、少于500個(gè)細(xì)胞、少于100個(gè)細(xì)胞、少于75個(gè)細(xì)胞、少于50個(gè)細(xì)胞、或少于25個(gè)細(xì)胞上進(jìn)行ChIP。
[0082]此外，據(jù)估計(jì)，一個(gè)細(xì)胞在染色質(zhì)中含有每個(gè)細(xì)胞約6X103ng的DNA以及等量的DNA和蛋白質(zhì)。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法包括在少至6X103ng DNA、或約12X103ng染色質(zhì)(等于I個(gè)細(xì)胞中DNA或染色質(zhì)的質(zhì)量)上進(jìn)行ChIP。
[0083]根據(jù)上文所述，ChIP目前在表觀遺傳分析中的使用需要至少一百萬個(gè)細(xì)胞的最少量并且通常更多，進(jìn)而將其實(shí)驗(yàn)性或診斷性使用局限于培養(yǎng)細(xì)胞模型或局限于僅大數(shù)量細(xì)胞(即，至少一百萬細(xì)胞)可用的情形。因此，本文所述方法提供了使用小數(shù)量細(xì)胞(少至20個(gè)細(xì)胞或甚至少至I個(gè)細(xì)胞)的意外的ChlP-seq結(jié)果。
[0084]經(jīng)由保護(hù)來回收(RePro)
[0085]RePro是一種ChlP-seq方法，其中添加載體DNA作為增量劑，以在小數(shù)量細(xì)胞的ChlP-seq期間減少DNA損失。載體DNA是一種低聚物，其長(zhǎng)度約200個(gè)堿基對(duì)至300個(gè)堿基對(duì)(“DNA1”)并且被5’生物素化(