一種免標(biāo)記熒光探針及其在檢測雙倍體g-四鏈體結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一類新型免標(biāo)記熒光探針，以及其在細(xì)胞內(nèi)外熒光檢測雙倍體G-四 鏈體核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] G-四鏈體（G-quadruplex)是一種特殊的DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。人類基因組中很多富含 鳥嘌呤（G)區(qū)域具有形成這一結(jié)構(gòu)的能力，包括端粒末端鳥嘌呤重復(fù)序列，以及多種基因的 啟動(dòng)子區(qū)域，如c-kil^c-myc^c-mytKbclUDGFARASJEGF、!^)和胰島素基因等。最新研 究表明，很多非編碼區(qū)的RNA序列也可以形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，RNA的G-四鏈體結(jié)構(gòu)比DNA 更穩(wěn)定，該結(jié)構(gòu)可能通過阻止基因的翻譯或參與蛋白結(jié)合識(shí)別的過程而達(dá)到抑制腫瘤生長 的效果。G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成對(duì)于體內(nèi)的一系列生理過程都存在調(diào)控作用。研究證明，某 些啟動(dòng)子區(qū)域的G-四鏈體結(jié)構(gòu)會(huì)顯著影響基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，因此G-四鏈體結(jié)構(gòu)被 認(rèn)為是起到分子開關(guān)的功能，其形成和拆散可能涉及到信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖等 一系列體內(nèi)重要的生理過程。所以，在體內(nèi)或者體外試驗(yàn)中，能夠特異性地檢測出G-四鏈 體結(jié)構(gòu)的存在或者形成，對(duì)于研究G-四鏈體結(jié)構(gòu)的相關(guān)生物學(xué)功能以及開發(fā)以G-四鏈體 結(jié)構(gòu)為靶點(diǎn)的抗癌藥物等方面都具有非常重要的作用。
[0003] 目前，在體內(nèi)和體外檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)的研究都取得了一些進(jìn)展。由于體內(nèi)大大 過量的雙螺旋DNA的存在，以及復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，使得體內(nèi)的檢測相對(duì)于體外檢測需要 解決更多的難題，目前已有一些熒光分子可以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)G-四鏈體結(jié)構(gòu)的檢測；體外實(shí)驗(yàn)中 檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)主要是通過儀器的手段，比如圓二色譜法、核磁共振、表面等離子共振、 熒光共振能量轉(zhuǎn)移等方法，這些方法對(duì)儀器和技術(shù)操作的要求都較高，而且價(jià)格較昂貴，基 本上不能普及使用。并且，目前大多數(shù)研究興趣集中于對(duì)某一構(gòu)象(如平行、反平行或混合 性）的單倍體G-四鏈體結(jié)構(gòu)的選擇性和靈敏度檢測，同時(shí)一個(gè)優(yōu)良的熒光探針在檢測靶向 G-四鏈體的同時(shí)，不能影響靶向分子的構(gòu)象和熱穩(wěn)定性，然而這樣的熒光分子報(bào)道很少。
[0004] 人端粒DNA是染色體末端由DNA重復(fù)序列TTAGGG組成的雙螺旋區(qū)，其末端是含有 100-200 nt核苷酸的富含G堿基的單鏈懸突，該端粒DNA懸突為端粒酶的底物，端粒酶的激 活和端粒的延長將導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。而這些富G的單鏈懸突，在一定的條件下可以形成復(fù) 雜的由TTA堿基對(duì)序列連接的雙倍體或者多倍體G-四鏈體結(jié)構(gòu)，通過一些熒光分子實(shí)現(xiàn)對(duì) 雙倍體或者多倍體G-四鏈體結(jié)構(gòu)的檢測，對(duì)研究G-四鏈體結(jié)構(gòu)的相關(guān)生物學(xué)功能以及開 發(fā)以G-四鏈體結(jié)構(gòu)為靶點(diǎn)的抗癌藥物等方面都具有重要的作用。而目前對(duì)雙倍體或多倍 體G-四鏈體的熒光檢測尚處于起步階段，報(bào)道的熒光分子不多。
[0005] 目前，只有文獻(xiàn)報(bào)道單個(gè)的表小檗堿能夠熒光檢測存在于K+溶液中的混合型單倍 體和多倍體G-四鏈體，且該熒光分子無法區(qū)分單倍體和多倍體G-四鏈體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)雙倍體G-四鏈體檢測方面的空白，本發(fā)明提供了一類免標(biāo)記的熒光探針，可 在溶液中區(qū)分單倍體和多倍體G-四鏈體；并且還能夠檢測出細(xì)胞中的G-四鏈體。本發(fā)明 探針不僅具有高靈敏度和選擇性識(shí)別，且不影響G-四鏈體結(jié)構(gòu)構(gòu)象和熱穩(wěn)定性。
[0007] 本發(fā)明目的在于提供醚鏈連接的對(duì)稱小檗堿二聚體衍生物作為G-四鏈體結(jié)構(gòu)檢 測探針的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 醚鏈連接的對(duì)稱小檗堿二聚體衍生物，其分子結(jié)構(gòu)如式I所示：
,其中η為2或3。
[0009] 上述醚鏈連接的對(duì)稱小檗堿二聚體衍生物作為G-四鏈體結(jié)構(gòu)檢測探針的應(yīng)用。 [0010] 進(jìn)一步的，上述G-四鏈體DNA結(jié)構(gòu)為雙倍體G-四鏈體結(jié)構(gòu)。
[0011] 進(jìn)一步的，上述的雙倍體G-四鏈體結(jié)構(gòu)為5' -A(GGGT TA)7G3-3'或 5' -A(GGGTTA)4(TTA GGG)4-3'序列構(gòu)成的雙倍體G-四鏈體結(jié)構(gòu)。
[0012] 上述的醚鏈連接的對(duì)稱小檗堿二聚體衍生物檢測雙倍體G-四鏈體結(jié)構(gòu)的方法， 其該方法為將待測DNA溶液中加入醚鏈連接的對(duì)稱小檗堿二聚體衍生物溶液，混勻，檢測 混合液的熒光強(qiáng)度，若待測DNA溶液的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了至少160倍，說明待測DNA中含有雙 倍體G-四鏈體結(jié)構(gòu)。
[0013] 進(jìn)一步的，上述待測DNA溶液的溶劑為含Na+的pH 6. 0~8. 0的Tris-HCl緩沖 液。
[0014] 進(jìn)一步的，上述醚鏈連接的對(duì)稱小檗堿二聚體衍生物溶液的溶劑為含Na+的pH 6. 0~8. 0的Tris-HCl緩沖液。
[0015] 進(jìn)一步的，上述待測DNA與醚鏈連接的對(duì)稱小檗堿二聚體衍生物的摩爾比為 (1~10) ：1〇
[0016] 上述醚鏈連接的對(duì)稱小檗堿二聚體衍生物檢測雙倍體G-四鏈體結(jié)構(gòu)的方法，包 括以下步驟： 1) 測定待測DNA溶液中DNA的濃度； 2) 往待測DNA溶液中加入醚鏈連接的對(duì)稱小檗堿二聚體衍生物，混勻，檢測混合液的 熒光強(qiáng)度； 3) 將上步測得的熒光強(qiáng)度和所述衍生物檢測雙倍體G-四鏈體結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)熒光光譜進(jìn) 行比對(duì)，即可判斷待測DNA中是否含有雙倍體G-四鏈體結(jié)構(gòu)，并確定具體含有哪種雙倍體 G-四鏈體結(jié)構(gòu)。
[0017] 上述醚鏈連接的對(duì)稱小檗堿二聚體衍生物檢測細(xì)胞中G-四鏈體結(jié)構(gòu)的方法，該 方法為將細(xì)胞與所述衍生物共孵2. 5~3. 5 h后，在熒光顯微鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光檢測，若細(xì) 胞產(chǎn)生明顯的熒光，說明細(xì)胞中含有G-四鏈體結(jié)構(gòu)。
[0018] 本發(fā)明的有益效果是： I)本發(fā)明探針穩(wěn)定，易得，并且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，便于儲(chǔ)存。
[0019] 2)本發(fā)明提供的探針可以特異性地結(jié)合雙倍體G-四鏈體結(jié)構(gòu)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)雙倍體 G-四鏈體結(jié)構(gòu)與其他核酸結(jié)構(gòu)的區(qū)分；本發(fā)明只需用簡單紫外燈或者熒光光譜就可以識(shí) 別出DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)G-四鏈體結(jié)構(gòu)，快捷，操作簡單，成本低廉。
[0020] 3)本發(fā)明探針免標(biāo)記熒光檢測雙倍體G-四鏈體，不影響其構(gòu)象和熱穩(wěn)定性。
[0021] 4)本發(fā)明探針1對(duì)雙倍體G-四鏈體G2T1的檢測靈敏度為0. 65 nM，探針2對(duì)雙 倍體G-四鏈體G2T2的檢測靈敏度可達(dá)I. 6 nM。
[0022] 5)本發(fā)明探針可以進(jìn)入細(xì)胞，可對(duì)細(xì)胞中的G-四鏈體結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測，使得此類探 針具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0023] 圖1為探針1對(duì)不同構(gòu)型DNA在紫外燈下的發(fā)光情況及熒光強(qiáng)度柱狀圖； 圖2為探針1加入不同濃度不同構(gòu)型DNA時(shí)在530 nm的熒光強(qiáng)度變化圖； 圖3為單倍體G-四鏈體Gl滴定探針1的熒光光譜圖；（a)單倍體Gl滴定探針1 (0. 5 μ M)的熒光光譜；（b)探針1 (0.5 μ M)的熒光強(qiáng)度與單倍體Gl濃度的線性圖。實(shí)驗(yàn)條 件：10 mM Tris-HCl buffer, 100 mM NaCl, pH 7. 2. λ ex/λ en = 355/530 nm ; 圖4為雙倍體G-四鏈體G2T1滴定探針I(yè)的熒光光譜；（a)探針I(yè)滴定雙倍體G2T1的 熒光光譜；（b)探針1 (0.5 μ M)的熒光強(qiáng)度與雙倍體G2T1濃度的線性圖。實(shí)驗(yàn)條件： 10 mM Tris-HCl buffer, 100 mM NaCl, pH 7. 2. λ ex/λ en = 355/530 nm ; 圖5為雙倍體G-四鏈體G2T2滴定探針I(yè)的熒光光譜；（a)探針I(yè)滴定雙倍體G2T2的 熒光光譜；（b)探針1 (0.5 μ M)的熒光強(qiáng)度與雙倍體G2T2濃度的線性圖。實(shí)驗(yàn)條件： 10 mM Tris-HCl buffer, 100 mM NaCl, pH 7. 2. λ ex/λ en = 355/530 nm ; 圖6為探針I(yè) (0.5 μ M)對(duì)不同濃度（0~0· 5 μ M)的Gl (a)和G2T1 (b)的靈敏度檢 測圖； 圖7為單倍體G-四鏈體Gl和雙倍體G-四鏈體G2T1在存在探針1時(shí)的CD譜； 圖8為他1&癌細(xì)胞在人6：; = 488 11111處不含（&、(1和8)和含（13、6和11)探針1(5以1) 反應(yīng)3 h時(shí)的共聚焦熒光細(xì)胞成像圖，及其疊加圖（c、f和i)。圖a~c、d~f和g~i分 別代表空白癌細(xì)胞（Control)、加了 DNA消化酶的癌細(xì)胞（DNase)和加了 RNA消化酶的癌細(xì) 胞（RNase); 圖9為探針2對(duì)不同構(gòu)型DNA在紫外燈下的發(fā)光情況及熒光強(qiáng)度柱狀圖； 圖10為單倍體G-四鏈體Gl滴定探針2的熒光光譜圖；(a)探針2滴定單倍體Gl的 熒光光譜；（b)探針2 (0.5 μ M)的熒光強(qiáng)度與單倍體Gl濃度的線性圖。實(shí)驗(yàn)條件：10 mM Tris-HCl 緩沖溶液，100 mM NaCl, pH 7· 2· λ ex/λ en =