玉米赤霉烯酮抗獨(dú)特型納米抗體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及玉米赤霉締酬抗獨(dú)特型納米抗體 (zearalenoneanti-idiotypicnanobodies)制備及其應(yīng)用.
【背景技術(shù)】
[0002] 玉米赤霉締酬狂earalenone，ZEN)是由鑲刀菌產(chǎn)生的一種類雌激素樣真菌毒素， 其化學(xué)名為6- (10-徑基-6氧基-十一碳締基）0 -雷鎖酸內(nèi)醋161~163°C，不溶于水，溶 于堿性溶液、乙酸、苯、甲醇化及乙醇等。玉米赤霉締酬廣泛存在于霉變的玉米、高梁、小麥、 燕麥、大麥等谷類作物W及奶中。產(chǎn)生玉米赤霉締酬最常見(jiàn)菌屬是禾谷鑲刀菌，此外為=線 鑲刀菌、木賊鑲刀菌、雪腐鑲刀菌、粉紅鑲刀菌等。ZEN具有類雌激素樣作用、生殖發(fā)育毒性、 免疫毒性、細(xì)胞毒性、肝毒性，對(duì)腫瘤產(chǎn)生也有一定影響，因此谷物在田間、收獲及在儲(chǔ)存過(guò) 程中一旦被ZEN污染，不僅會(huì)給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，更重要的是可能對(duì)人類和動(dòng) 物的健康造成嚴(yán)重的危害，因此對(duì)食品中ZEN的檢測(cè)具有重要意義。
[0003] 目前比較常用的檢測(cè)ZEN方法有：高效液相色譜法，氣相色譜法，薄層層析法，高 效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，免疫檢測(cè)法等，但W免疫學(xué)檢測(cè)方法較為方便、實(shí)用，適合于大 規(guī)模樣品的快速檢測(cè)。免疫學(xué)檢測(cè)方法往往設(shè)及到使用毒素小分子標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)建立標(biāo)準(zhǔn)曲 線。用標(biāo)準(zhǔn)品的劣勢(shì)首先在于毒素小分子提取工作困難，現(xiàn)在我國(guó)大多使用進(jìn)口產(chǎn)品，而且 某些產(chǎn)品進(jìn)口受限，運(yùn)樣相對(duì)增加了成本，最重要的是毒素分子標(biāo)準(zhǔn)品的使用很容易造成 環(huán)境的污染和對(duì)操作人員身體的危害。因此，人們開(kāi)始利用抗獨(dú)特型抗體和抗原模擬表位 來(lái)實(shí)現(xiàn)有害小分子物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的替代，并取得了一定的進(jìn)展。隧菌體展示膚庫(kù)技術(shù)的主要 特點(diǎn)是可有效地篩選出與目標(biāo)祀體特異結(jié)合的隧菌體展示多膚，并且在探索受體與配體之 間相互作用結(jié)合位點(diǎn)、尋求高親和力生物活性的配體分子、探索未知蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)表位 等方面應(yīng)用廣泛。
[0004] 本發(fā)明通過(guò)用隧菌體展示技術(shù)，從駝源天然單域重鏈抗體庫(kù)中篩選能與祀分子 (抗ZEN單克隆抗體）特異性結(jié)合的納米抗體，W納米抗體作為ZEN抗原的替代物應(yīng)用于免 疫學(xué)分析檢測(cè)領(lǐng)域。該方法避免了傳統(tǒng)抗獨(dú)特型抗體制備所需的動(dòng)物免疫過(guò)程，且具有普 遍適用性，篩選得到的納米抗體具有與天然ZEN分子相似的免疫反應(yīng)特性，可替代價(jià)格昂 貴且毒性強(qiáng)的ZEN標(biāo)準(zhǔn)品，并作為競(jìng)爭(zhēng)抗原或固相包被抗原應(yīng)用于ZEN的免疫學(xué)檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明W抗ZEN單克隆抗體為祀分子，將祀分子固相包被于酶標(biāo)板上，投入駝源 天然單域重鏈抗體庫(kù)進(jìn)行親和淘選，獲得了一種玉米赤霉締酬抗獨(dú)特型納米抗體狂6)，其 具有SEQIDNO. : 1所示的氨基酸序列。
[0006]其氨基酸序列的IMGT編號(hào)和結(jié)構(gòu)域劃分如圖1所示。
[0007]本發(fā)明所提及的納米抗體包括四個(gè)框架區(qū)（化ameworkregion,FR)和S個(gè)互補(bǔ) 決定區(qū)（Complementarit^determiningregion,CDR)。其中，框架區(qū)（FR1-FR4)分別選自 沈QIDNO. :2,沈QIDNO. :4,沈QIDNO.:6和沈QIDNO. :8,互補(bǔ)決定區(qū)（CDR1-CDR3)分 別選自SEQIDNO. :3,SEQIDNO. :5和SEQIDNO. :7?？蚣軈^(qū)結(jié)構(gòu)相對(duì)保守，主要起著維 持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用；互補(bǔ)決定區(qū)結(jié)構(gòu)相對(duì)多樣化，主要負(fù)責(zé)抗體的識(shí)別。
[0008] 本發(fā)明提供一種蛋白質(zhì)或多膚，包含沈Q ID NO. :2,沈Q ID NO. :4,沈Q ID NO. :6 和SEQ ID NO. :8中的一個(gè)或兩個(gè)及W上的氨基酸序列，且至少與其中一個(gè)的氨基酸序列有 90%同源性。
[0009] 本發(fā)明提供一種蛋白質(zhì)或多膚，包含SEQIDNO. : 3,沈QIDNO. : 5和沈QIDNO. : 7 中的一個(gè)或兩個(gè)及W上的氨基酸序列，且至少與其中一個(gè)的氨基酸序列有80%同源性。
[0010] 本發(fā)明還設(shè)及編碼該納米抗體氨基酸序列的核巧酸，其序列為SEQIDNO. :9。
[0011] 本發(fā)明提及的納米抗體可通過(guò)隧菌體擴(kuò)增或基因工程重組表達(dá)的方式進(jìn)行大量 制備。隧菌體擴(kuò)增是指將展示有該納米抗體的隧菌體，通過(guò)生物擴(kuò)增的方式，大量繁殖生產(chǎn) 展示有該納米抗體的隧菌體粒子。基因工程重組表達(dá)的方式是指將編碼該納米抗體的基 因，通過(guò)克隆至表達(dá)載體，W蛋白表達(dá)的形式進(jìn)行該納米抗體的大量制備。
[0012] 本發(fā)明還設(shè)及所述納米抗體在非疾病診斷治療目的免疫學(xué)檢測(cè)分析中的應(yīng)用。免 疫學(xué)檢測(cè)的類型包括酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)、膠體金免疫層析、免疫斑點(diǎn)雜交等基于抗原-抗 體特異性反應(yīng)的免疫學(xué)分析檢測(cè)類型。
[0013] 本發(fā)明所述的納米抗體在應(yīng)用時(shí)，可W通過(guò)隧菌體擴(kuò)增獲得的展示有納米抗體的 隧菌體粒子直接用于分析檢測(cè)，當(dāng)然，也可W將納米抗體經(jīng)過(guò)原核生物或真核生物表達(dá)后 W蛋白的形式進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)分析。該納米抗體W固相抗原或競(jìng)爭(zhēng)抗原在非疾病診斷治療 目的免疫學(xué)檢測(cè)分析中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明還設(shè)及該納米抗體在非疾病診斷治療目的免疫學(xué)檢測(cè)分析中的應(yīng)用，具體 為納米抗體在制備ZEN的模擬物試劑中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明中所敘述的一些術(shù)語(yǔ)具有如下含義：
[0016] 同源性：描述兩個(gè)或多個(gè)氨基酸序列的相似程度，第一個(gè)氨基酸序列和第二個(gè)氨 基酸序列之間的同源性百分比可W通過(guò)【第一氨基酸序列中與第二氨基酸序列中相應(yīng)位置 處的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的數(shù)量】除W【第一個(gè)氨基酸序列中氨基酸總數(shù)】再乘W 【100%】來(lái)計(jì)算，其中第二氨基酸序列中的某個(gè)氨基酸的缺失、插入、替換或添加（與第一 氨基酸相比）被認(rèn)為是有差別。另外，同源性百分比也可W利用已知的用于序列比對(duì)的計(jì) 算機(jī)運(yùn)算程序（如：NCBIBlast)獲得。
[0017] 結(jié)構(gòu)域：蛋白質(zhì)=級(jí)結(jié)構(gòu)的基本結(jié)構(gòu)單位，通常具有一定的功能。
[0018]IMGT編號(hào)：IMGT數(shù)據(jù)庫(kù)（TheInternationalImMunoGeneTicsDat油ase)中的一 種已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的抗體氨基酸序列編號(hào)方法。具體編號(hào)方法可W參考文獻(xiàn)巧虹enmann，F(xiàn).，Q. Kaas,etal. (2010). "IMGT/3Dst;ructure-DBandIMGT/DomainGapAli即：adatabase andatoolforimmunoglobulinsorantibodies,Tcellreceptors,MHC,IgSF andMhcSF."NucleicAcidsRes38 化atabaseissue) :D301-307.Lefranc,M.P.,C. Pommie,etal. (2003)."IMGTuniquenumberingforimmunoglobulinandTcell receptorvariabledomainsandIgsuperfamilyV-Iikedomains."DevCompTmmunol 27(1) :55-77.)中的描述。
[0019]密碼子（codon):亦稱S聯(lián)體密碼（tripletcode)，指對(duì)應(yīng)于某種氨基酸的核巧 酸=聯(lián)體。在轉(zhuǎn)譯過(guò)程中決定該種氨基酸插入生長(zhǎng)中多膚鏈的位置。
[0020] 前述納米抗體可W替換價(jià)格昂貴且毒性強(qiáng)的ZEN標(biāo)準(zhǔn)品，并作為競(jìng)爭(zhēng)抗原或固相 包被抗原應(yīng)用于ZEN的免疫學(xué)檢測(cè)，該納米抗體具有與天然ZEN分子相似的免疫反應(yīng)特性， 效果良好。
[0021] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明納米抗體可W替代價(jià)格昂貴且毒性強(qiáng)的ZEN標(biāo)準(zhǔn) 品，并作為競(jìng)爭(zhēng)抗原或固相包被抗原應(yīng)用于ZEN的免疫學(xué)檢測(cè)。該納米抗體具有與天然ZEN 分子相似的免疫反應(yīng)特性，可提高ZEN檢測(cè)靈敏度，減少ZEN標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)操作人員健康和環(huán)境 的危害，節(jié)約成本。本發(fā)明制備納米抗體的方法具有普遍適用性，可用于其他小分子物質(zhì)抗 原替代物的篩選和制備，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1為納米抗體狂6)的氨基酸編號(hào)及結(jié)構(gòu)域示意圖。
[0023] 圖2為W納米抗體狂6)建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測(cè)范圍為 0.2_1.22ng/mL，ICso為 0. 49ng/mL。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 實(shí)施例1.駝源天然單域重鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建
[00巧]1)駝源白細(xì)胞的分離：在離屯、管中加入淋己細(xì)胞分離液，再緩慢加入等體積血液 樣品，1000 g離屯、50min;小屯、吸取中間層懸浮的白細(xì)胞至一新的離屯、管中，加入1/2體積的 PBS，1000 g離屯、15min;棄上清，用PBS洗下離屯、管壁上的白細(xì)胞，1000 g離屯、IOmin;棄上 清，加入500yLPBS重懸白細(xì)胞并計(jì)數(shù)；W體積比1 :15加入裂解液（RNAiso)保存?zhèn)溆谩?br>[0026] 2)總RNA提取：向上述裂解液中加入1/4體積的氯仿，劇烈震蕩20s使其充分乳 化，室溫靜置5min;4°C12000g離屯、15min，取上清轉(zhuǎn)移至另一新鮮離屯、管中；加入等體積 的異丙醇，充分混勻后室溫靜置IOmin;4°C1000 Og離屯、20min，棄上清，緩慢加入75%乙醇 1血，小屯、洗涂離屯、管管壁；4°C，12000g離屯、5min后棄去乙醇；室溫干燥沉淀5min，加入適 量的RNase-化ee水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80°C保存。
[0027] 3)cDNA的合成：將反轉(zhuǎn)錄用的引物、dNTPMixUire和模板RNA混合，65°C5min，迅 速冰浴。具體配制如下：
[0029] 然后在上述Microtube中配置下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：
[0030]
[0032]PCR儀上按下列條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42°C35min，50°C45min，70°ClOmin。PCR產(chǎn) 物于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0033] 4)抗體可變區(qū)基因擴(kuò)增：將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。
[0034]第一輪PCR :
[0036]PCR反應(yīng)條件：96°CImin;98°C6s，55°C20s，72°C65s，35cycles;75°ClOmin。
[0037] 采用試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，適當(dāng)稀釋后作為第二輪PCR的模板。
[0038]第二輪PCR:
[0039]
[0040]PCR反應(yīng)條件：94°C5min;98°C8s，52°C15s，72°C50s，6cycles;98°C10s，68°C45s，30cycles;72°C7min。
[00川。文庫(kù)構(gòu)建：