一種黃精β-半乳聚糖及其制備方法和抑制細(xì)胞凋亡的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及從中草藥黃精分離純化得到的目-半乳聚糖HJW0S300-2的抑制細(xì)胞 調(diào)亡的作用。具體涉及該多糖制備用于抗衰老作用W及防曬功能的化妝品W及保健品中。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃精（Polygonatumsibiricum)，又名老虎姜、雞頭姜，為百合科黃精屬多種植 物的干燥塊莖。黃精具有滋腎養(yǎng)陰，補(bǔ)中益氣，延年益壽等功效。主要分布于甘肅和陜 西。藥理研究表明，黃精具有抗衰老、增強(qiáng)免疫、提高學(xué)習(xí)和記憶能力、抗炎、抗病毒、降血 糖等作用。黃精含有黃精皂巧、煙酸、糖類、釀?lì)?、氨基酸及微量元素。對黃精水提物的化 學(xué)成分進(jìn)行分析的過程中發(fā)現(xiàn)，黃精水提物的主要有效成分為黃精多糖。黃精在治癖、抗 衰老等方面的作用，與其水溶性成分密切相關(guān)。黃精多糖具有多種生理功能，例如黃精多 糖具有抗菌、抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤等功效（林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2005, 25(2); 80-82 ;中成藥，2012, :34(4) :694-697 ;中草藥，2006, 37 (8) :1132-11：34 ;Carbohy化ate polymers, 2007, 70:304-309)。但是，迄今為止對黃精多糖中的單一均一組分的研究報(bào)道還 不多，對于各種單一組分的構(gòu)效關(guān)系W及藥理活性作用機(jī)制也不明確。送種情況并不利于 黃精多糖的應(yīng)用和開發(fā)。
[0003] 由于多糖是極性大分子化合物，酸性條件下能引起多糖巧鏈的斷裂。因此，它常用 的提取分離方法大多為熱水提取，酶提取法。提取液中的游離蛋白質(zhì)主要用Sevage法、H 氣己酸法和H氣H氯己焼法H種方法沉淀去除。小分子雜質(zhì)可用一定截留范圍的透析袋， 利用透析法除去。得到透析袋內(nèi)物質(zhì)濃縮醇沉后的植物提取粗多糖。
[0004] 本發(fā)明首次從黃精中分離純化得到目-半乳聚糖HJW0S300-2,經(jīng)過甲基化、"C NMR、iHNMR分析可知，該多糖是一種新型的目-半乳聚糖，與已知報(bào)道的黃精均一多糖的結(jié) 構(gòu)不同。
[0005] 由于各種因素，導(dǎo)致現(xiàn)代人皮膚不斷出現(xiàn)各種問題，如皺紋，瘦瘡，皮膚劇黑，雀斑 等。據(jù)了解，目前女性最關(guān)心最熱口的保養(yǎng)項(xiàng)目為"抗衰老保養(yǎng)"。皮膚，作為一個(gè)可見的外 在器官，使得我們能意識(shí)到衰老的過程。因此，皮膚被認(rèn)為是研究衰老最理想的器官模型。 皮膚衰老的主要特征表現(xiàn)于干燥，色素沉著，氣色不好，毛細(xì)管擴(kuò)張，松弛，產(chǎn)生皺紋。皮膚 衰老可分為內(nèi)源性衰老和外源性衰老。根據(jù)自由基理論認(rèn)為，衰老可由大量的活性氧自由 基（RO巧所造成的結(jié)果。ROS可作為正常細(xì)胞代謝形成的副產(chǎn)物，也可W是由于環(huán)境因素如 UV照射W及外界的一些刺激所產(chǎn)生。在正常生理?xiàng)l件下，細(xì)胞會(huì)自我形成復(fù)雜而精細(xì)的抵 御系統(tǒng)抑制增加的氧化壓力。但是，送種抵御系統(tǒng)會(huì)被一些內(nèi)在或者外在的因素破壞，如衰 老，疾病，紫外線照射，環(huán)境污染等。一旦送一平衡打破，細(xì)胞中的ROS水平會(huì)增加，從而引 起氧化損傷。嚴(yán)重的氧化應(yīng)激和生物分子的氧化損傷可導(dǎo)致細(xì)胞調(diào)亡。
[0006] 為了滿足人們對抗衰老產(chǎn)品的需求，已經(jīng)將抗壞血酸及其衍生物，原花青素，茶多 酪、或具有抗氧化作用的物質(zhì)用于美容或醫(yī)學(xué)藥物中，然而將它們加入化妝品時(shí)會(huì)可能帶 來皮膚安全性，配方和穩(wěn)定性等問題，因此人們對抗衰老新化合物的開發(fā)還在不斷進(jìn)行中。
[0007] 近年來隨著對植物多糖研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)許多中草藥富含活性多糖成 分，具有抗衰老，抗老年癡呆等多種作用，且都與其抗氧化作用密切相關(guān)。同時(shí)，多糖，做為 一種活性綠色化合物，不會(huì)在體內(nèi)堆積，能提高產(chǎn)品的安全性。多糖具有良好的親水性，也 使得其能更好地與化妝品其他成分配伍。
[000引我們發(fā)現(xiàn)，用于改善皮膚，抗氧化作用的含有黃精80%醇提物的化妝品組合物是 已知的（CN102209527A)，但是黃精多糖在皮膚抗衰老的應(yīng)用還未見報(bào)導(dǎo)。同時(shí)關(guān)于黃精多 糖對大鼠抗氧化作用（中國現(xiàn)代醫(yī)生，49(5) :6-11,2011)，對血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作 用（時(shí)珍國醫(yī)國藥，22 (3) :623-624,2011)W及清除自由基作用（湖南中醫(yī)藥雜志，22(4): 90-96, 2006)已有報(bào)導(dǎo)，但是關(guān)于黃精多糖對皮膚成纖維細(xì)胞的抗氧化作用還未知，而對于 從黃精粗多糖中分離純化出的確定結(jié)構(gòu)的均一多糖單組分對皮膚成纖維細(xì)胞的抗氧化作 用更為未知。本發(fā)明首次研究了黃精目-半乳聚糖HJW0S300-2能有效抑制肥02對成纖維 細(xì)胞的氧化損傷引起的調(diào)亡。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種新型的黃精目-半乳聚糖HJW0S300-2保護(hù)細(xì)胞免受氧 化損傷，在抗成纖維細(xì)胞調(diào)亡方面的應(yīng)用。本發(fā)明的黃精目-半乳聚糖HJW0S300-2能保護(hù) 成纖維細(xì)胞由&化的刺激引起的調(diào)亡。通過MT檢測細(xì)胞活力W及從流式細(xì)胞儀檢測活細(xì) 胞百分?jǐn)?shù)，都能說明HJW0S300-2能保護(hù)細(xì)胞免受損傷。胖63*6^61〇*結(jié)果表明，町胖05300-2 能抑制&化引起的細(xì)胞內(nèi)化spase3的活化，進(jìn)一步證實(shí)了該多糖具有抑制細(xì)胞調(diào)亡作用， 因而有望開發(fā)為抗衰老的功效添加劑并應(yīng)用。
[0010] 在本發(fā)明的一方面，提供了一種新型的黃精目-半乳聚糖HJW0S300-2,該黃精 目-半乳聚糖的結(jié)構(gòu)式重復(fù)單元如下：
[001引分子量范圍在8-15邸日，其平均分子量Mw為10邸a。
[0013] 本發(fā)明的另一方面涉及黃精目-半乳聚糖HJW0S300-2的制備方法，該方法包括W 下步驟：
[0014] a)脫脂，然后熱水提取；
[001引b)透析，然后脫蛋白，然后堿中和；
[001引C)透析，然后醇沉；
[0017] d)收集沉淀，得到水提黃精粗多糖HJW;
[0018] e)水提黃精粗多糖用DEAE-纖維素陰離子交換柱層析進(jìn)行分離，洗脫后透析，得 到產(chǎn)物町WO ;
[0019] f)取步驟e)所得產(chǎn)物HJW0,上Se地ac巧1S-300凝膠柱，洗脫后透析，得到最終產(chǎn) 物町W0S300-2。
[0020] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述步驟a)包括取黃精生藥材，用有機(jī)溶劑浸泡脫 月旨，然后用熱水提取。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述步驟b)包括合并提取液，濃縮，用 流動(dòng)水透析，透析內(nèi)液濃縮后加入30% (w/v)的H氣己酸水溶液脫蛋白，然后堿中和至抑 值7. 0-8.0。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述步驟C)包括用流動(dòng)水透析，透析內(nèi)液濃縮 后，加入2-5倍體積的95%己醇進(jìn)行醇沉。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述步驟d)包括 收集沉淀，用無水己醇和丙麗洗涂，烘干，得到水提黃精粗多糖HJW。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施 方式中，所述步驟e)包括水提黃精粗多糖用DEAE-纖維素陰離子交換柱層析進(jìn)行分離，用 去離子水進(jìn)行洗脫，洗脫液濃縮后用去離子水透析，透析液經(jīng)減壓濃縮并冷凍干燥，得到產(chǎn) 物HJW0。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述步驟f)包括取步驟e)所得產(chǎn)物HJW0,用氯化 鋼溶解，離必，上清液上Se地ac巧1S-300凝膠柱，用0. 2mol/L氯化鋼溶液洗脫，洗脫液濃縮 后用去離子水透析，透析液經(jīng)減壓濃縮并冷凍干燥，得到最終產(chǎn)物HJW0S300-2。
[0021] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，使用的有機(jī)溶劑選自：己醇，丙麗，氯仿。
[0022] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述步驟a)使用的溫度范圍；60~100°C。
[0023] 在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述步驟a) -直進(jìn)行到采用硫酸-苯酪法檢 測無顏色。
[0024] 在本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述步驟b)中加入H氣己酸水溶液脫蛋白 的操作是W1:1 (v/v)的濃縮液：H氣己酸水溶液加入的。
[00巧]在本發(fā)明的另一方面，提供了一種黃精目-半乳聚糖HJW0S300-2在抗衰老或防曬 作用的化妝品中的應(yīng)用，其中所述聚糖的結(jié)構(gòu)式如下：
[0027] 分子量范圍在8-15邸日，其平均分子量Mw為10邸a。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述聚糖 的比旋光度為[a]25d+42°，其中測定條件為25C，濃度為5mg/ml的水溶液。
[0028] 在本發(fā)明的另一方面，提供了一種黃精目-半乳聚糖HJW0S300-2在抑制成纖維細(xì) 胞調(diào)亡中的應(yīng)用，其中所述聚糖的結(jié)構(gòu)式如下：
[0030] 分子量范圍在8-15KDa,其平均分子量Mw為lOKDa。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述聚糖 的比旋光度為[a]25d+42°，其中測定條件為25°C，濃度為0. 5mg/ml的水溶液。
[0031] 在本發(fā)明的另一方面，提了一種具有抗衰老或防曬作用的化妝品，其特征在于，所 述化妝品包含本發(fā)明制備得到的黃精目-半乳聚糖W及化妝品領(lǐng)域可接受的賦形劑。在一 個(gè)實(shí)施方式中，所述化妝品選自：潔面乳、化妝水、乳液、膏霜、睹囑、面膜。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí) 施方式中，所述黃精目-半乳聚糖的使用量為0.0001%-10% (w/w)。優(yōu)選的濃度范圍為 0. 001% -5%