一種用于激活肺癌特異性免疫反應(yīng)的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種增強抗癌免疫的試劑盒，尤其設(shè)及一種用于激活肺癌特異性免疫 反應(yīng)的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。 近50年來許多國家都報道肺癌的發(fā)病率和死亡率均明顯增高，男性肺癌發(fā)病率和死亡率 均占所有惡性腫瘤的第一位，女性發(fā)病率占第二位，死亡率占第二位。
[0003] 自進入二十一世紀W來，分子生物學(xué)與免疫學(xué)的長足進步為臨床腫瘤治療提供了 新的策略。通過分子生物學(xué)的手段已鑒定出大量的腫瘤細胞特異性的抗原，并通過生物信 息學(xué)的手段分析出其被免疫細胞識別的位點，運為重建患者的腫瘤特異性免疫反應(yīng)帶來的 可能。但是最近十年W來的一系列臨床試驗結(jié)果顯示，W腫瘤特異性抗原膚為基礎(chǔ)的腫瘤 疫苗的臨床效果令人失望，其中一個重要的原因是抗原提呈過程的缺陷。
[0004] XiZhao等人用慢病毒感染的DC細胞使其持續(xù)性高表達外源性IL12,發(fā)現(xiàn)DC.IL12 細胞能夠高效的誘導(dǎo)抗原特異性CTL細胞的產(chǎn)生，將DC.IL12與腫瘤抗原膚回輸至小鼠體 內(nèi)可顯著性的縮小腫瘤腫塊。感染空載病毒的DC細胞并不能有效的激發(fā)相應(yīng)的免疫反應(yīng)， 回輸后對小鼠的腫瘤大小無顯著性的影響。該研究提示了高表達IL12的DC細胞對于腫瘤 疫苗發(fā)揮其抗癌臨床作用的重要性。
[0005] DC細胞是哺乳類動物體內(nèi)具有抗原提呈能力的一類細胞，其主要功能是攝取、加 工處理和遞呈抗原，激活或調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。T細胞因此被激活而生成MHC-I類限制 性CD8陽性細胞毒性T細胞（切totoxicTlymphoc5rte，CTL)和M肥-II類限制性的CD4 陽性的一型T輔助細胞（typelThelper,Thl)。一型極化樹突狀細胞燈ypelPolarized Demlriticcell,DC1)是成熟DC細胞的一類亞群，具有強有力的免疫激活能力。DCl細胞 的重要的特征是高表達IL12P70W及免疫激活共刺激分子，可高效的激活抗原特異性的 CD8巧細胞和CD4+Thl細胞相關(guān)的免疫反應(yīng)。RcAbieB.Mailliard等證實了DCl體外誘導(dǎo) 黑色素瘤抗原特異性的CTL細胞的能力可達到正常的成熟DC細胞的40倍W上。A^iana TLarregina等人還發(fā)現(xiàn)DCl細胞誘導(dǎo)B16黑色素瘤抗原特異性CD4+輔助性T細胞，并且 促進CD4+輔助性T細胞對腫瘤組織的浸潤。因此，高表達IL12的DCl細胞負載腫瘤特異 性抗原膚可W為增強抗原膚為基礎(chǔ)的腫瘤治療療效提供了一種策略，但現(xiàn)有技術(shù)中還沒有 能夠相應(yīng)的、成熟的并適用于激活肺癌病人特異性免疫反應(yīng)的試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題提出一種試劑盒用于肺癌的臨床治療。體外 誘導(dǎo)腫瘤患者自體的DC細胞，獲得富集DCl細胞的產(chǎn)物；DCl細胞負載腫瘤特異性膚段組 合，可W用于體外或體內(nèi)的腫瘤抗原特異性的細胞毒性T細胞的誘導(dǎo)。
[0007] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所提供的技術(shù)措施為：
[0008] 本發(fā)明提供了一種用于激活肺癌特異性免疫反應(yīng)的試劑盒，包括有RPMI-1640培 養(yǎng)基、細胞培養(yǎng)上清、GM-CSF、IL-4、INF丫W(wǎng)及肺癌特異性抗原多膚組合；其中，所述細 胞培養(yǎng)上清為NK細胞與K562細胞共培養(yǎng)上清或者T細胞培養(yǎng)上清；所述肺癌特異性抗 原多膚組合包括MAGE-A1-A2、MAGE-A1-A3、MAGE-A3-A2、MAGE-A4-A2/3、CEA-A2、CEA-A3、 hTERT-A2、hTERT-A3、Survivin-A2 及Survivin-A3 抗原多膚，其多膚序列分別如SEQID No. 1，SEQIDNo. 2,SEQIDNo. 3,SEQIDNo. 4,SEQIDNo. 5,SEQIDNo. 6,SEQIDNo. 7， 沈QIDNo. 8,SEQIDNo. 9 及沈QIDNo. 10 所示。
[0009] 為了進一步優(yōu)化上述技術(shù)方案，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括：
[0010] 優(yōu)選地，NK細胞與K562細胞共培養(yǎng)上清通過將K562細胞與NK細胞按1:2至1:10 比例共培養(yǎng)并加入IFNa，24小時后收集培養(yǎng)基上清而獲得。
[0011] 優(yōu)選地，所述T細胞培養(yǎng)上清的制備過程中，首先分離外周血單核細胞，淋己細胞 分離液分理單個核細胞，用CD8磁珠分選出CD8巧細胞后，接種至培養(yǎng)基中，加入CD3CD28 Beads, 24h后加入等量培養(yǎng)基，4化后收集T細胞培養(yǎng)上清。
[0012] 優(yōu)選地，利用試劑盒激活肺癌病人腫瘤特異性免疫反應(yīng)包括W下步驟：
[0013] 步驟一，分離病人外周血中的單核細胞，細胞短暫貼壁培養(yǎng)之后，移除懸浮細胞， 加入誘導(dǎo)劑GM-CSF和IL-4培養(yǎng)兩天，培養(yǎng)第3天，第5天更換一半量的培養(yǎng)基，并加入肺 癌特異性抗原多膚組合，獲得負載有肺癌特異性抗原多膚組合的成熟DC細胞；
[0014] 步驟二，將所述步驟一中制得的成熟DC細胞用INF丫W(wǎng)及所述的NK細胞與K562 細胞共培養(yǎng)上清進一步培養(yǎng)誘導(dǎo)兩天，使所述的成熟DC細胞分化為DCl細胞；
[0015] 步驟=，利用步驟二所獲得的DCl細胞進行體內(nèi)主動誘導(dǎo)和/或體外被動誘導(dǎo)。
[0016] 優(yōu)選地，所述NK細胞來源于人類廝帶血。
[0017] 優(yōu)選地，所述T細胞培養(yǎng)上清為利用自體或異體T細胞獲得。
[0018] 優(yōu)選地，所述步驟=中的體內(nèi)主動誘導(dǎo)過程為將所述步驟二所獲得的DCl細胞回 輸?shù)讲∪梭w內(nèi)。
[0019] 優(yōu)選地，所述步驟=中的體外被動誘導(dǎo)過程為將所述步驟二所獲得的DCl細胞與 T細胞混合培養(yǎng)，并再次負載肺癌特異性抗原多膚，然后收集細胞，回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)。
[0020] 優(yōu)選地，試劑盒還可W包括GG巧51培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基。
[0021] 本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)效果體現(xiàn)在W下幾個 方面：
[0022] 首先，本發(fā)明提供了一組用于肺癌免疫治療的特異性抗原多膚組合，該組合包含 了多種肺癌細胞的特異性表達抗原的膚段。運些膚段包括了HLA-A2與A3呈遞的序列區(qū)域， 覆蓋了 80%W上的已報道的肺癌細胞特異性抗原。因此，我們提供了一種新的肺癌特異性 抗原多膚組合，有利于激活罹患肺癌病人的針對腫瘤細胞的獲得性免疫反應(yīng)。
[0023] 其次，本發(fā)明還提供了一種利用本發(fā)明的試劑盒，體外制備成熟DCl細胞，用于負 載肺癌細胞特異性抗原組合的方法。與常用誘導(dǎo)方案相比，利用本發(fā)明試劑盒所制備的產(chǎn) 物中擁有成熟表型的DC細胞含量顯著性提高（如CD80，CD86，CD4化等表面抗原高表達）； 經(jīng)過SCD4化刺激之后，DCl細胞IL12P70表達量大大高于通用方案制備細胞的表達量。由 此可見，本發(fā)明提供了一個更有效成熟DCl細胞制備方案，所得細胞產(chǎn)物可W用于肺癌細 胞特異性抗原負載。
[0024] 最后，本發(fā)明提供了一種用于肺癌治療的DCl負載抗原膚的臨床應(yīng)用方案。DCl細 胞負載腫瘤特異性抗原之后，一部分細胞回輸至患者體內(nèi)，另一部分用于體外腫瘤抗原特 異性的誘導(dǎo)細胞毒性T細胞（CTL)，通過體內(nèi)/體外，主動誘導(dǎo)/被動誘導(dǎo)相結(jié)合的方式激 活肺癌病人特異性的免疫反應(yīng)。
【附圖說明】
[00巧]圖1為利用本發(fā)明的試劑盒（細胞培養(yǎng)上清為NK細胞與K562細胞共培養(yǎng)上清） 制備的DCl細胞與常規(guī)方案制備的成熟DC細胞相比，CCR7,CD70,HLA-DR，CD83,CD86等DC 細胞與免疫激活相關(guān)的標志物表達量情況；
[0026] 圖2為本發(fā)明的試劑盒（細胞培養(yǎng)上清為T細胞培養(yǎng)上清）制備的DCl細胞（10% 和40 %比例的T細胞培養(yǎng)上清）與常規(guī)方案制備的對照DC細胞相比，CD11C，CD70，HLA-DR， CD83,CD86等DC細胞與免疫激活相關(guān)的標志物表達量情況；
[0027] 圖3為經(jīng)過SCD40L激活之后，本發(fā)明試劑盒（細胞培養(yǎng)上清為NK細胞與K562細 胞共培養(yǎng)上清）制備的DCl細胞所分泌的IL-12與常規(guī)方案制備的成熟DC細胞分泌量之 對比；
[0028] 圖4為經(jīng)過SCD4化激活之后，本發(fā)明試劑盒（細胞培養(yǎng)上清為T細胞培養(yǎng)上清） 制備的DCl細胞（10%和40%比例的T細胞培養(yǎng)上清）所分泌的IL-12與常規(guī)方案制備的 成熟DC細胞分泌量之對比；
[0029] 圖5為本發(fā)明試劑盒（細胞培養(yǎng)上清為NK細胞與K562細胞共培養(yǎng)上清）制備的 DCl細胞誘導(dǎo)T細胞之后，ELIspot試驗中IFN丫分泌水平與常見方案制備的DC細胞誘導(dǎo) 之對比；
[0030] 圖6為本發(fā)明試劑盒（細胞培養(yǎng)上清為T細胞培養(yǎng)上清）制備的DCl細胞（10% 和40%比例的T細胞上清）誘導(dǎo)T細胞之后，ELIspot試驗中IFN丫分泌水平與常見方案 制備的DC細胞誘導(dǎo)之對比。
【具體實施方式】
[0031] 本發(fā)明提供了一種用于激活肺癌特異性免疫反應(yīng)的試劑盒，包括有RPMI-1640培 養(yǎng)基、細胞培養(yǎng)上清、GM-CSF、IL-4、INF丫W(wǎng)及肺癌特異性抗原多膚組合；其中，所述細 胞培養(yǎng)上清為NK細胞與K562細胞共培養(yǎng)上清或者T細胞培養(yǎng)上清；所述肺癌特異性抗 原多膚組合包括MAGE-A1-A2、MAGE-A1-A3、MAGE-A3-A2、MAGE-A4-A2/3、CEA-A2、CEA-A3、 hTERT-A2、hTERT-A3、Survivin-A2 及Survivin-A3 抗原多膚，其多膚序列分別如SEQID No. 1，SEQIDNo. 2,SEQIDNo. 3,SEQIDNo. 4,SEQIDNo. 5,SEQIDNo. 6,SEQIDNo. 7， 沈QIDNo. 8,SEQIDNo. 9 及沈QIDNo. 10 所示。
[0032] 下面通過具體實施例對本發(fā)明進行詳細和具體的介紹，W使更好的理解本發(fā)明， 但是下述實施例并不限制本發(fā)明范圍。
[0033] 實施例一（細胞培養(yǎng)上清為T細胞培養(yǎng)上清）
[0034] 在利用本發(fā)明的試劑盒激活肺癌病人特異性免疫反應(yīng)時，首先進行成人外周血來 源的一型極化樹突狀細胞的制備（type1polarizedden化iticcell,DC1)。外周血單 個核細胞分離參照根據(jù)化nuleit等（GeneTher. 2003 10(3))所述的方法。首先用通過 Ficoll-Hypaque密度梯度離屯、分離外周血單個核細胞，并收集血漿用于后續(xù)的培養(yǎng)。按密 度3.OXlOVml，將細胞接種至T75培養(yǎng)瓶中，并在GG巧51培養(yǎng)基中加入10 %血漿，置于 37. (TC、飽和濕度、5%C〇2環(huán)境中培養(yǎng)。培養(yǎng)化后，洗去懸浮的淋己細胞，加入含GM-CSF和 IL-4 1000IU/mlW及10%血漿的DMEM/F12培養(yǎng)基。貼壁細胞培養(yǎng)第3天，第5天更換一 半量的培養(yǎng)基。培養(yǎng)第五天，更換含5 %血漿培養(yǎng)基并加入T細胞上清10%，并按照終濃度 加入加入IFNa，培養(yǎng)二十小時之后再加入20ug/ml的poly-I:C。如圖2所示，經(jīng)過6天的 誘導(dǎo)，制備產(chǎn)物顯示出了明顯的DC細胞的表型，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示CD83,CD86等與 免疫激活相關(guān)的標志物達到了 95%W上，說明制備產(chǎn)物中DC細胞純度極高。通過圖4也 可W看出，DCl細胞經(jīng)過SCD4化刺激之后，高表達IL12,由本發(fā)明試劑盒制備的DC細