一種l-鼠李樹膠糖-1-磷酸醛縮酶在催化合成稀有糖中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是設(shè)及一種k鼠李樹膠糖-1-憐酸醒縮酶在 催化合成稀有糖中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 稀有糖定義為自然界中存在但含量非常低的單糖及其衍生物。稀有糖一般具有類 似于薦糖的甜度，但幾乎不產(chǎn)生或產(chǎn)生較少的熱量。稀有糖在食品、醫(yī)藥、保健等領(lǐng)域應(yīng)用 前景廣泛。WD-阿洛酬糖值-psicose)為例進(jìn)行說明，D-阿洛酬糖是自然界中含量非常 低的六碳糖，是D-果糖C-3位點的差向異構(gòu)體。D-阿洛酬糖很難被消化吸收，幾乎不為生 命活動提供能量，因此是一種非常有用的低卡路里的甜味劑。
[0003]在食品應(yīng)用領(lǐng)域，D-阿洛酬糖具有甜度高、溶解性好、低卡路里和低血糖反應(yīng)等優(yōu) 點，被認(rèn)為是最理想的薦糖替代品之一。在食品中添加D-阿洛酬糖，不僅能提高它的膠凝 度，還可W與食品蛋白發(fā)生美拉德反應(yīng)改善其風(fēng)味。相對于D-果糖和D-葡萄糖，D-阿洛 酬糖可W生成更多的抗氧化美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，維持食品更長時間的抗氧化水平。2011年， D-阿洛酬糖被抑A認(rèn)證安全，可在食品和膳食領(lǐng)域作為添加劑使用。在醫(yī)藥健康領(lǐng)域，D-阿 洛酬糖可W抑制脂肪肝酶和腸道a-糖巧酶，從而降低體內(nèi)脂肪的積累和抑制血糖濃度的 上升。在膳食中添加D-阿洛酬糖可W降低餐后血糖反應(yīng)，提高膜島素的敏感性和葡萄糖耐 受性。另外，相對其他稀有糖，D-阿洛酬糖能更加有效地清除活性氧自由基。在小鼠試驗 中，發(fā)現(xiàn)D-阿洛酬糖可W通過抑制活性氧的產(chǎn)生來阻止雙-(2-乙基己基）-鄰苯二甲酸誘 發(fā)的對睪丸的傷害。此外D-阿洛酬糖對6-徑基多己胺誘導(dǎo)的細(xì)胞調(diào)亡有神經(jīng)保護(hù)的作用， 同時還能抑制高濃度葡萄糖誘導(dǎo)下的單核細(xì)胞趨化蛋白MCP-I的表達(dá)。運就預(yù)示著D-阿洛 酬糖具有治療神經(jīng)組織退化和動脈粥樣硬化等相關(guān)疾病的潛在功能。當(dāng)前主要是用D-塔 格糖-3-差向異構(gòu)酶家族酶類用來催化D-果糖的差向異構(gòu)來生成D-阿洛酬糖。由于D-果 糖和D-阿洛酬糖的相互轉(zhuǎn)化是一個平衡的過程，W較高的收率大量生產(chǎn)D-阿洛酬糖依然 面臨著挑戰(zhàn)。當(dāng)前，大多數(shù)稀有糖的合成路線仍然有限，且常常W相對比較昂貴的化合物作 為底物，導(dǎo)致稀有糖的合成成本依然很高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本部分的目的在于概述本發(fā)明的實施例的一些方面W及簡要介紹一些較佳實施 例。在本部分W及本申請的說明書摘要和發(fā)明名稱中可能會做些簡化或省略W避免使本部 分、說明書摘要和發(fā)明名稱的目的模糊，而運種簡化或省略不能用于限制本發(fā)明的范圍。
[0005] 鑒于上述和/或現(xiàn)有稀有糖合成中存在的問題，提出了本發(fā)明。
[0006] 因此，本發(fā)明的目的是提供一種k鼠李樹膠糖-1-憐酸醒縮酶在催化合成稀有糖 中的應(yīng)用。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種k鼠李樹膠糖-1-憐酸醒 縮酶在催化合成稀有糖中的應(yīng)用。
[0008] 作為本發(fā)明所述的k鼠李樹膠糖-1-憐酸醒縮酶在催化合成稀有糖中的應(yīng)用 的一種優(yōu)選方案，其中：所述k鼠李樹膠糖-1-憐酸醒縮酶來源于嗜熱菌化ermotoga maritimaMSB8,其基因序列表如SP9所示。
[0009] 作為本發(fā)明所述的k鼠李樹膠糖-1-憐酸醒縮酶在催化合成稀有糖中的應(yīng)用的 一種優(yōu)選方案，其中：所述k鼠李樹膠糖-1-憐酸醒縮酶在大腸桿菌重組菌中進(jìn)行表達(dá)和 純化。
[0010] 作為本發(fā)明所述的k鼠李樹膠糖-1-憐酸醒縮酶在催化合成稀有糖中的應(yīng)用的 一種優(yōu)選方案，其中：所述大腸桿菌重組菌的重組方法為，將如SEQIDNo1所示的k鼠李 樹膠糖-1-憐酸醒縮酶基因片段連接到祀T-43.Ia載體上，并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Rosetta值E3)中，得到大腸桿菌重組菌。
[0011] 作為本發(fā)明所述的k鼠李樹膠糖-1-憐酸醒縮酶在催化合成稀有糖中的應(yīng)用的 一種優(yōu)選方案，其中：所述表達(dá)和純化，包括，培養(yǎng)大腸桿菌重組菌至ODe。。= 0. 8-1. 0,添加 終濃度為0. 1-l.OmMIPTG，在15-37°C，120~220巧m條件下誘導(dǎo)4~16h;用含有10-20mM 咪挫的緩沖液洗脫雜蛋白，用含有300-500mM咪挫的緩沖液洗脫純酶。
[0012] 作為本發(fā)明所述的k鼠李樹膠糖-1-憐酸醒縮酶在催化合成稀有糖中的應(yīng)用的 一種優(yōu)選方案，其中：所述合成，包括，向反應(yīng)體系中加入底物化-3-憐酸甘油、醒受體、憐 酸甘油氧化酶、過氧化氨酶、L-鼠李樹膠糖-1-憐酸醒縮酶，在氧氣存在的環(huán)境下，25-35°C 反應(yīng)12-20h后，調(diào)節(jié)抑為4. 0-5. 0,加入酸性憐酸酶，35-39°C反應(yīng)12-2化。
[0013] 作為本發(fā)明所述的k鼠李樹膠糖-1-憐酸醒縮酶在催化合成稀有糖中的應(yīng)用的 一種優(yōu)選方案，其中：所述醒受體為D-甘油醒、k甘油醒或甘油醒的衍生物。
[0014] 作為本發(fā)明所述的k鼠李樹膠糖-1-憐酸醒縮酶在催化合成稀有糖中的應(yīng)用的 一種優(yōu)選方案，其中：所述k鼠李樹膠糖-1-憐酸醒縮酶為帶標(biāo)簽的融合蛋白或不帶標(biāo)簽 的蛋白。
[0015] 本發(fā)明為避免直接使用憐酸二徑基丙酬值HAP)，大幅度降低合成稀有糖的成本， 采用"一蓋四酶法"的策略，利用來源于嗜熱菌ThermotogamaritimaMSB8的心鼠李樹膠 糖-1-憐酸醒縮酶進(jìn)行了D-阿洛酬糖、D-山梨糖、k果糖和k塔格糖等一系列稀有糖的 合成，實驗證明該醒縮酶具有很好熱穩(wěn)定性，并且在WD-甘油醒為受體時，能夠W很高的 選擇性來合成具有重要應(yīng)用價值的D-阿洛酬糖。
【附圖說明】
[0016] 圖1為溫度對于化aD醒縮酶的影響示意圖。
[0017] 圖2為稀有糖合成的HPLC檢測圖，A為W D-甘油醒為受體，B為W k甘油醒為受 體。
【具體實施方式】
[0018] 為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合說明書附圖對 本發(fā)明的【具體實施方式】做詳細(xì)的說明。
[0019] 在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)W便于充分理解本發(fā)明，但是本發(fā)明還可W 采用其他不同于在此描述的其它方式來實施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的 情況下做類似推廣，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實施例的限制。
[0020] 其次，此處所稱的"一個實施例"或"實施例"是指可包含于本發(fā)明至少一個實現(xiàn) 方式中的特定特征、結(jié)構(gòu)或特性。在本說明書中不同地方出現(xiàn)的"在一個實施例中"并非均 指同一個實施例，也不是單獨的或選擇性的與其他實施例互相排斥的實施例。
[0021]k鼠李樹膠糖-1-憐酸醒縮酶巧haD醒縮酶）由TM1072基因編碼，將基因序列 優(yōu)化后進(jìn)行人工合成的TM1072基因片段，插入到表達(dá)質(zhì)粒祀T-43.Ia得到重組表達(dá)質(zhì)粒 ET-43.la-TM1072。祀T-43.la-TM1072質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta值E3)用來表達(dá)化aD醒縮 酶。挑取含有重組質(zhì)粒的單克隆接種到50血LB液體培養(yǎng)基（50iig/血卡那霉素），37。 200巧m，過夜培養(yǎng)。吸取20mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到ILLB液體培養(yǎng)基（50yg/mL卡那霉素），37°C， 20化pm振蕩培養(yǎng)。當(dāng)ODe。。為0. 8~1. 0時，加入IPTG(終濃度為0.ImM)，16°C誘導(dǎo)2化后，停 止培養(yǎng)，離屯、，棄去上清，得到菌體（4000g，30min，4°C)。菌體超聲波破碎，破碎條件：80W功 率，破碎2s，間隔2s，破碎液高速離屯、（leOOOg，30min，4°C)，得到的上清液用來純化目的蛋 白。首先用平衡緩沖液50mMTris-HCUpH7. 5)對Ni2+親和層析柱進(jìn)行平衡后上樣，上樣完 畢后，用洗涂緩沖液巧OmMTris-HCUpH7. 5) ,IOOmM化Cl,IOmM咪挫）洗掉W較小吸附力 結(jié)合在柱子上的雜蛋白；最后用洗脫緩沖液巧OmM化is-肥1(抑7. 5) ,IOOmM化Cl, 500ml 咪挫）洗脫目的蛋白并收集，洗脫液用超濾管進(jìn)行濃縮和脫鹽。為了切除Nus-化aD融合蛋 白的Nus標(biāo)簽，用凝血酶進(jìn)行處理，反應(yīng)體系為120JiLNus-化aD蛋白（18mg/mL)，2JiL凝 血酶（lU/yL)，補(bǔ)(1地2〇至1血，37°C反應(yīng)30min后，反應(yīng)液進(jìn)行離屯、（15000g，10min，4°C) 上清液用Ni2^-NTA柱純化，由于Nus-化aD融合蛋白的Nus標(biāo)簽和化S標(biāo)簽均位于凝血酶作 用位點的N端，不含有Nus標(biāo)簽的化aD酶能夠很容易地從儀柱上洗脫下來，并用超濾管進(jìn) 行濃縮和脫鹽。
[0022] 溫度對化aD醒縮酶的影響
[0023]為了測定溫度對化aD醒縮酶的影響，反應(yīng)體系如下：2. 5yLDHAP(0. 2M)，1. 5yL D-甘油醒（0. 5M)，19. 5yLd地2〇。加入化aD化.2mg/mL，1. 5yL)在 10 ~70°C反應(yīng) 20min 后加入5yL6N肥1終止反應(yīng)，12000巧m離屯、IOmin使反應(yīng)液澄清，用2N化OH調(diào)節(jié)抑至 5后加入0. 1yL酸性憐酸酶在37 °C反應(yīng)12h。反應(yīng)液抑用IN化OH調(diào)節(jié)為抑7. 0?；痑D 的酶活根據(jù)HPLC測得產(chǎn)生的稀有糖的量來測定。相對酶活定義為化aD的酶活相對于最大 酶活的百分比。
[0024] 如圖1所示，為了研究溫度對于化aD醒縮酶的影響，WDHAP和D-甘油醒作為底 物，在不同溫度下，W不帶有Nus標(biāo)簽的化aD醒縮酶作為催化劑，進(jìn)行反應(yīng)，酶活用HPLC進(jìn) 行測定。結(jié)果顯示：化aD醒縮酶在40~60°C顯示了相對較高的酶活，其中50°C是該酶的 反應(yīng)最適溫度。化aD在70°C酶活的迅速下降原因是DHAP在該溫度下不穩(wěn)定。
[0025] 化aD的立體選擇性分析
[0026] 化aD醒縮酶催化的反應(yīng)底物為兩個：第一個為DHAP(憐酸二徑基丙酬），第二個為 醒類，本研究所用的醒類為D-甘油醒或k甘油醒。
[0027] 如圖2所示：
[002引 當(dāng)化aD(帶有Nus標(biāo)簽）WDHAP和D-甘油醒為底物時，主要生成D-阿洛酬糖，還 有少量D-山梨糖產(chǎn)生，二者的比例約為15:1。當(dāng)化aD(不帶有Nus標(biāo)簽）WDHAP和D-甘 油醒為底物時，D-阿洛酬糖和D-山梨糖二者的比例約為15:1。