一種結(jié)核桿菌dna的提取純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及結(jié)核桿菌技術(shù)領(lǐng)域，具體為結(jié)核桿菌的DNA提取純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺結(jié)核病是由結(jié)核桿菌引起的一種人畜共患的慢性傳染病，是目前單一傳染性細(xì) 菌致人死亡的主要因素。近年來，隨著艾滋病的流行、多種惡性腫瘤患者的增多W及多重抗 藥性菌株的出現(xiàn)，更是增加了結(jié)核菌感染癥防治上的困難。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全世界有結(jié)核病 菌感染者20億（占總?cè)丝?1/3)，每秒鐘感染一人，全球結(jié)核病菌每年新感染800萬人，如 果不立即采取防擴(kuò)散措施，結(jié)核病將在今后10年內(nèi)奪去3000多萬人的生命。我國(guó)全國(guó)結(jié) 核病感染者3. 3億，結(jié)核病人600萬，每年因結(jié)核病死亡的病人高達(dá)25萬，為各類傳染病死 亡總和的兩倍，因此我國(guó)已將結(jié)核病由丙類傳染病升為乙類傳染病，列入嚴(yán)格管理范疇。據(jù) WHO統(tǒng)計(jì)，全世界每年有5千萬至一億人感染結(jié)核，約=百萬人死于結(jié)核病，其中80%W上 在發(fā)展中國(guó)家。因此，如何快速盡早地診斷并治療成為控制結(jié)核病擴(kuò)散和傳播的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
[0003] 眾所周知，要想對(duì)DNA進(jìn)行鑒定，必須得到足量且純凈的DNA樣本，DNA提取純化 技術(shù)是醫(yī)學(xué)DNA檢驗(yàn)的第一個(gè)步驟，也是最關(guān)鍵的步驟。運(yùn)些生物檢材中除了DNA外還包 括許多物質(zhì)，在分析DNA之前，必須將DNA同其他物質(zhì)分離開來。可W說，能否成功進(jìn)行DNA 檢驗(yàn)取決于能否從生物檢材中獲得高質(zhì)量DNA。傳統(tǒng)的DNA提取法有C肥LEX提取法：該方 法雖然提取DNA量較多，但對(duì)微量、污染的檢材效果欠佳。而且該方法提取的DNA中常存在 PCR擴(kuò)增抑制物，且不宜長(zhǎng)期保存，運(yùn)些都可能使擴(kuò)增效率下降或擴(kuò)增失敗。由此看到，雖然 運(yùn)些方法可W提取出較多的DNA樣本，但是由于提取純度較低，含有較多PCR抑制物，影響 了接下來的擴(kuò)增過程，運(yùn)樣也就影響了DNA的檢驗(yàn)。提取結(jié)核桿菌DNA的最大難點(diǎn)是如何 破其牢固的細(xì)胞壁，一般細(xì)菌用細(xì)胞裂解液即可使其破壁，但對(duì)于提取結(jié)核桿菌DNA，細(xì)胞 裂解液不能有效破壁。所W如何能提取出較純凈的結(jié)核桿菌DNA顯得十分的必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種能夠提取高純度的結(jié)核桿菌 DNA的方法，包含W下步驟：
[0005] -種結(jié)核桿菌DNA的提取純化方法，包括W下步驟：
[0006] (1)取結(jié)核桿菌的細(xì)菌懸液于試管中；
[0007] (2)用抑值8. 0的0.OlM邸TA洗涂細(xì)菌，離屯、后沉淀，棄上清液；
[000引 做向步驟似的沉淀中加入抑值為8. 0的TES，5% (W/V)SDS，于35~40°C下 溶解30~60min后沸水浴30~60min，再于冰上放置3~7min;
[000引 （4)向步驟做的產(chǎn)物中加入抑值4. 8的NaAc和濃度為0. 05mol/l的葡萄糖，顛 倒混勻后冰上放置3~7min;
[0010] (5)向步驟（4)獲得的試液中加入苯酪/氯仿/異戊醇（25 :24 :1)，顛倒混勻后于 離屯、處理后沉淀，取上層水相；
[0011](6)向步驟巧）中的上層水相中加入等體積的氯仿/異戊醇（24 :1)，顛倒混勻并 離屯、處理后沉淀，取上層水相；
[0012] (7)向步驟化）中的上層水相中加入無水乙醇，充分震蕩后離屯、處理后，在一 5~一30°C下沉淀20~40min;
[001引 做取步驟（7)的沉淀物，驚干3-5分鐘，加入TE緩沖液，得到結(jié)核桿菌DNA溶液。 [0014] 優(yōu)選的，所述步驟（3)中的TES中含有濃度為18~23mg/ml溶菌酶。
[001引優(yōu)選的，所述的離屯、處理的條件為1200化/min的IOmin離屯、。
[0016] 優(yōu)選的，所述步驟（3)中處理?xiàng)l件為：于37°C下溶解40min后沸水浴40min，再于 冰上放置5min;
[0017] 優(yōu)選的，所述步驟（7)中處理?xiàng)l件為在一20°C下沉淀30min。在低溫條件下可使 得DNA更容易沉淀，且可保護(hù)DNA不被降解。
[0018] 由于結(jié)核菌細(xì)胞壁堅(jiān)固，常規(guī)方法難W有效破除。導(dǎo)致結(jié)核菌DNA難化溢出菌體， 故很大程度上影響DNA提取得率。本發(fā)明利用溶菌酶是一種能水解致病菌細(xì)胞壁的堿性 酶，且該酶的最適工作溫度為攝氏37度，故將高濃度溶菌酶溶解至TES緩沖液中，配成結(jié)核 菌細(xì)胞壁裂解液，并且使該酶處于約37°C的最適溫度范圍下，水浴約40分鐘左右，使其充 分反應(yīng)，從而裂解結(jié)核菌細(xì)胞壁，沸水浴的目的有兩個(gè)：第一，在裂解細(xì)胞壁的工作完成后， 為了避免溶菌酶繼續(xù)反應(yīng)，溶解其他可能接觸到的細(xì)菌，造成雜類DNA污染，因此我們用沸 水浴，產(chǎn)生高溫使得溶菌酶失活。第二，沸水浴條件下，也可使溶菌酶裂解不充分的結(jié)核菌 細(xì)胞壁得到進(jìn)一步破碎，從而進(jìn)一步提高DNA得率。因此，上述方法目的即在于充分破碎結(jié) 核菌細(xì)胞壁，得到的結(jié)核桿菌DNA的純度和濃度較高，提取效率高。
【附圖說明】
[0019] 圖1為QPCR(實(shí)時(shí)巧光定量PCR)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；
[0020] 圖2為QPCR(實(shí)時(shí)巧光定量PCR)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0021] 圖3為3 %瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；
【具體實(shí)施方式】：
[0022] 下面結(jié)合具體實(shí)施例和對(duì)比實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0023] 實(shí)施例1 :
[0024] -種結(jié)核桿菌DNA的提取純化方法，包括W下步驟：
[00巧](1)取600y1結(jié)核桿菌的細(xì)菌懸液于試管中；
[0026] (2)用抑值8. 0的0.OlM邸TA洗涂細(xì)菌，離屯、后沉淀，棄上清液；
[0027] 做向步驟似的沉淀中加入抑值為8.0的600ylTES，5% (W/V)SDS120yl，于 35°C下溶解30min后沸水浴30min，再于冰上放置3min;
[002引 （4)向步驟（3)的產(chǎn)物中加入500yIpH值4. 8的NaAc和100y1濃度為0. 05mol/ 1的葡萄糖，顛倒混勻后冰上放置3min;
[002引 妨向步驟（4)獲得的試液中加入600y1苯酪/氯仿/異戊醇（25 :24 :1)，顛倒 混勻后于離屯、處理后沉淀，取上層水相；
[0030] (6)向步驟巧）中的上層水相中加入等體積的氯仿/異戊醇（24 :1)，顛倒混勻并 離屯、處理后沉淀，取上層水相；
[003。（7)向步驟（6)中的上層水相中加入Iml無水乙醇，充分震蕩后120(K)r/min離屯、 IOmin處理后，在一5°C下沉淀20min;
[003引做取步驟（7)的沉淀物，驚干3分鐘，加入20y1TE溶解液，待用。
[003引實(shí)施例2:
[0034] -種結(jié)核桿菌DNA的提取純化方法，包括W下步驟：
[0035] (1)取600y1結(jié)核桿菌的細(xì)菌懸液于試管中；
[0036] (2)用抑值8. 0的0.0 lM邸TA洗涂細(xì)菌，離屯、后沉淀，棄上清液；
[0037] 做向步驟似的沉淀中加入抑值為8. 0的600y1TES，5% (W/V)SDS120y1， 于40°C下溶解60min后沸水浴60min，再于冰上放置7min;
[003引（4)向步驟（3)的產(chǎn)物中加入500y1抑值4. 8的NaAc和100y1濃度為0. 05mol/ 1的葡萄糖，顛倒混勻后冰上放置7min;
[003引 妨向步驟（4)獲得的試液中加入600y1苯酪/氯仿/異戊醇（25 :24 :1)，顛倒 混勻后于離屯、處理后沉淀，取上層水相；
[0040] (6)向步驟巧）中的上層水相中加入等體積的氯仿/異戊醇（24 :1)，顛倒混勻并 離屯、處理后沉淀，取上層水相；
[00川（7)向步驟（6)中的上層水相中加入Iml無水乙醇，充分震蕩后120(K)r/min離屯、 IOmin處理后，在一30°C下沉淀40min;
[0042] (8)取步驟（7)的沉淀物，驚干5分鐘，加入20y1TE溶解液，待用。
[004引 實(shí)施例3
[0044] -種結(jié)核桿菌DNA的提取純化方法，包括W下步驟：
[0045] (1)取600y1結(jié)核桿菌的細(xì)菌懸液于試管中；
[0046] (2)用抑值8. 0的0.0 lM邸TA洗涂細(xì)菌，離屯、后沉淀，棄上清液；
[0047] 做向步驟似的沉淀中加入抑值為8. 0的600y1TES，5% (W/V)SDS120y1，于 37°C下溶解40min后沸水浴40min，再于冰上放置5min;
[004引（4)向步驟（3)的產(chǎn)物中加入500y1抑值4. 8的NaAc和100y1濃度為0. 05mol/ 1的葡萄糖，顛倒混勻后冰上放置5min;
[004引 妨向步驟（4)獲得的試液中加入600y1苯酪/氯仿/異戊醇（25 :24 :1)，顛倒 混勻后于離屯、處理后沉淀，取上層水相；
[0050] (6)向步驟巧）中的上層水相中加入等體積的氯仿/異戊醇（24 :1)，顛倒混勻并 離屯、處理后沉淀，取上層水相；
[005。（7)向步驟（6)中的上層水相中加入Iml無水乙醇，充分震蕩后120(K)r/min離屯、 IOmin處理后，在一20°C下沉淀30min;
[005引做取步驟（7)的沉淀物，驚干5分鐘，加入20ylTE溶解液，待用。
[00閲實(shí)施例4
[0054] 與實(shí)施例1的區(qū)別在于步驟（3)中的抑值為8.0的TES中，含有濃度為18mg/ml 的溶菌酶。
[00財(cái) 實(shí)施例5
[0056] 與實(shí)施例2的區(qū)別在于步驟（3)中的抑值為8.0的TES中，含有濃度為23mg/ml 的溶菌酶。
[0057] 實(shí)施例6
[005引與實(shí)施例3的區(qū)別在于步