3’ race-primer:5' -TCCCCCTCCTCTCCTTCCA-3’。
[0040]用T17AP引物代替Oligo (dT)引物進行RNA反轉(zhuǎn)合成第一鏈⑶NA，根據(jù)測序所得的基因片段設(shè)計上游基因特異性引物3’ race-primer,以AP作為下游引物，使用TaKaRa公司的LA酶反應(yīng)體系進行PCR:
(I)按下列組成配制PCR反應(yīng)液，20μ?體系:
10XLA Buffer 2μ?，dNTP Mixture (各 2.5mM) 3.2μ?，MgCl2 (25mM) 2μ?, AP 0.8μ?,3’ race-primer 0.8)J-L, cDNA lVL, LA Taq 0.2VL, ddH20 1KL0
[0041](2) PCR 反應(yīng)條件:94°C 5min ；94°C 30sec,56°C 30sec,72°C 30sec，35 Cycles ；72°C 1min,4°C forever。
[0042]擴增完成后，取全部PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳目的片段切膠回收，與TaKaRaPMD19-T Vector (D102A)連接、感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化，挑取單菌落PCR檢測后選取2~3個進行測序。
[0043]采用5’ RACE技術(shù)獲得基因上游序列:
使用 Clontech 的 SMARTer ? RACE cDNA Amplificat1n Kit 進行反轉(zhuǎn)錄，按說明書操作，合成5’RACE使用cDNA，根據(jù)測序所得的基因片段設(shè)計特異性上游引物(23~28 nt,50-60% GC, Tm ^ 65°C ):
GSPl:5，-ATAAGCGACATTACATCAGAATCAACGGCG-3'。
[0044]以5’ RACE的cDNA為模板，加入合成的GSPl和通用引物UPM (Clontech的SMARTer ?RACE cDNA Amplificat1n Kit 提供)，按 Clontech 的 Advantage 2 PCR Kit (6392)說明書操作，進行PCR擴增。
[0045]PCR 擴增體系(41.5PL):PCR-Grade Water 34.5μ?，10 X Advantage 2 PCR Buffer5KL，dNTP Mix (1mM) lVL, 50 X Advantage 2 Polymerase Mix IKL0
[0046]渦旋混勻，并離心到管底。再加入:5’-RACE-ReadycDNA 2.5μ?, UPM (10) 5μ?,GSPl (1uM) ?μ?，F(xiàn)inal volume 50μ?。
[0047]PCR 反應(yīng)條件:5 cycles:94 °C 30sec ；72 °C 3min。5 cycles:94 °C 30sec，70°C 30sec，72°C 3min。25 cycles:94°C 30sec，68°C 30sec，72°C 3min。
[0048]擴增完成后，取全部PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳目的片段切膠回收，與TaKaRaPMD19-T Vector (D102A)連接、感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化，挑取單菌落PCR檢測后選取2~3個進行測序。
[0049]反應(yīng)結(jié)束后，取5μ1的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。將驗證后有正確條帶的菌液委托英駿公司測序，使用通用引物Μ13測序，測序結(jié)果到NCBI上進行同源性比對，確定是否 /3ZU基因特異性片段。(網(wǎng)址為:http://blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)
全長克隆及基因的序列分析。首先將3’ -race和5’ -race的測序結(jié)果手動去除載體即接頭序列；使用DNAMAN軟件進行拼接，這兩個片段含有重疊區(qū)域，所以可以拼接成一條核苷酸鏈，即/YM基因全長序列。然后根據(jù)拼接結(jié)果用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計全長引物對克隆/5ZM全長并進行驗證，引物為:
PIN1-WH0LE1 -.5' -CGACTCCCTTGGCAACTATC-3'，
PIN1-WH0LE2 -.5' -AGCCCAAGGAAAATGTAGTAAAC-3r 。
[0050]PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3.結(jié)果分析，/5ZM基因全長2341bp，序列如SEQ ID N0.1所示，包括610個氨基酸的開放閱讀框(ORF)和312bp的3’ UTR和196bp的5’非翻譯區(qū)。其ORF為1833bp，序列如SEQ IDN0.2所示，包含了 ATG開頭的翻譯起始位點和TGA結(jié)尾的翻譯終止密碼子，所編碼的蛋白序列如SEQ ID N0.3所示。對/YM進行BLAST分析，核苷酸序列比對顯示與毛果楊(trichocarpa )的/3ZM基因同源性為71%，在蛋白水平上與葡萄(Vitis vini fera)同源性最高，達76% ;其次為毛果楊生長素運輸?shù)鞍?，同源性?5%。
[0051]實施例2
(I)基因功能驗證
首先構(gòu)建鵝掌楸表達載體，并將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草，獲得過表達/5ZM基因的陽性轉(zhuǎn)基因植株，觀察表型，推測鵝掌楸/YM功能。
[0052](2)載體的構(gòu)建
本發(fā)明所用大腸桿菌菌株為E.coli DH5 α ;表達載體為pBI 121(B1vector C0., LTD公司購入)。具體過程如下:
1.通過PCR在/YM基因上下游分別添加BamHI和SacI酶切位點。PCR體系及反應(yīng)條件同全長擴增，引物分別是:
w-S+BamH1-.5' -CGCGGGATCCATGATCACTCTCTCCGACTT-3'，w-A+Sac1-.5' -CGGAGCTCTCACAGCCCAAGGAAAAT-3'。
[0053]PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，用AxyPr印DNA Gel Extract1n Kit回收純化。
[0054]2.使用BamHI和SacI內(nèi)切酶進行酶切，得到含有粘性末端的并覆蓋整個ORF的PINl基因片段。用同樣的酶切反應(yīng)處理空的PBI 121表達載體。
[0055]酶切的反應(yīng)體系(20uL):0.5XK buffer I uL，BamHI luL，SmaI I uL，PCR 產(chǎn)物17 uLo
[0056]37°C水浴，酶切3h。加入10 X終止液停止酶切反應(yīng)，1%瓊脂糖凝膠電泳分離，雙酶切結(jié)果如圖4，圖5，圖6所示，根據(jù)條帶大小判斷出PINl基因和pBI121表達載體已經(jīng)被正確切開。用AxyPrep DNA Gel Extract1n Kit (AXYGEN)回收純化酶切產(chǎn)物，溶于20ul的TE緩沖液中。
[0057]3.檢測酶切產(chǎn)物濃度，按連接體系加入各試劑(目的片段分子數(shù):載體分子數(shù)=3:1~5:1) 16°C過夜，進行連接。連接反應(yīng)體系如下:T4 DNA ligase buffer ( 1X )
2.5uL，酶切的表達載體2 uL，酶切的PINl PCR產(chǎn)物8 uL，T4 DNA ligase I uL，補充H2O到 20 uLο
[0058]4.重組子的鑒定。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，挑取單菌落接種到LBY液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)過夜；使用全長引物進行菌液PCR，以篩選陽性克隆，之后用AxyPrep Plasmid MiniprepKit (AXYGEN)提取質(zhì)粒進行酶切驗證。同時測序檢測載體構(gòu)建過程中是否發(fā)生突變或者缺失現(xiàn)象。構(gòu)建表達載體如圖7所示。
[0059](3)實時熒光定量PCR
選取雜交鵝掌楸基因型163024的體胚發(fā)生過程中不同發(fā)育時期同步化材料，包括胚性愈傷和非胚性愈傷、懸浮系細胞以及利用胚性愈傷組織誘導(dǎo)獲得的液體繼代培養(yǎng)基中胚胎單細胞；液體調(diào)整培養(yǎng)基中生長兩天后胚胎細胞；胚胎誘導(dǎo)培養(yǎng)一周的球型胚；誘導(dǎo)培養(yǎng)二周的魚雷胚；誘導(dǎo)培養(yǎng)三周的子葉胚；成熟的子葉胚。分別提取雜交鵝掌楸體胚發(fā)生過程中不同發(fā)育時期同步化材料的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板，進行半定量RT-PCR(Sem1-Quantitative 町-?0?)和實時熒光定量？0?$0 RT-PCR)來驗證PINl 基因在各階段表達差異，進一步分析PINl蛋白調(diào)控的規(guī)律及分子機制。
[0060]實時定量PCR采用ABI 公司的 Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒，在 ABI7500 Real time PCR Systems (Applied B1systems)上完成，每個樣品反應(yīng)三次重復(fù)，數(shù)據(jù)提取分析采用 7500 System SDS software (Applied B1systems) 0 具體過程如下:
I) RT-PCR引物的設(shè)計根據(jù)克隆得到的序列設(shè)計一對PCR引物，通過