一種雜交鵝掌楸LhRGL1基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雜交鵝掌楸LhRGLl基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]雜交鵝掌楸是我國著名林木遺傳育種家葉培忠教授利用分布在我國的中國鸛掌楸{Lir1dendron chinensis (Hems1.) Sarg.)和和分布在北美的北美鸛掌楸{Lir1dendron tulipifera Linn.)通過人工雜交獲得的種間雜交種，其生長速度快，樹姿優(yōu)美，葉形奇特，抗性強，材質(zhì)紋理細膩，是重要的園林綠化和工業(yè)用材樹種。雜交鵝掌楸雖然有許多優(yōu)越性，但雜交制種受到季節(jié)和效率的限制，影響了雜交鵝掌楸的推廣應(yīng)用，由于植物體細胞胚具有數(shù)量多，一旦形成體細胞胚就能夠快速發(fā)育成再生植株的特點，以體細胞胚胎發(fā)生技術(shù)快速繁殖種子來源困難的雜交鵝掌楸，具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。體胚發(fā)生技術(shù)由于其兩極性、繁殖速度快、效率高等特點，已經(jīng)成為優(yōu)良林木資源快速無性繁殖的重要手段，并且它能和生物反應(yīng)器結(jié)合實現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。到目前為止，已經(jīng)成功利用雜交種體細胞建立了雜交鵝掌楸體細胞胚胎發(fā)生技術(shù)和快速成苗體系，開辟了雜交鵝掌楸產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的新途徑。體細胞胚發(fā)生的本質(zhì)是細胞分化的問題，而細胞分化的分子基礎(chǔ)則是基因差異表達與調(diào)控的結(jié)果。所以研究這些相關(guān)基因可以使我們更好的了解體細胞發(fā)生技術(shù)的原理。
[0003]利用基因工程技術(shù)，可以將雜交鵝掌楸生長過程中的相關(guān)基因分離出來，挖掘在生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要基因的功能，從而可以更加直接的進行品種改良。研究表明，激素類物質(zhì)在雜交鵝掌楸的生長中發(fā)揮重要作用，包括生長素(Auxin)、細胞分裂素(cytokinin, CTK)、赤霉素(GA)、乙稀(Ethylene, ΕΤΗ)和脫落酸(Abscisic acid, ΑΒΑ)等。其中赤霉素GA類對伸長生長有重要作用，可以明顯促進細胞的伸長。
[0004]DELLA蛋白是一類N端含有17個氨基酸序列，其中前5個氨基酸的縮寫為DELLA(Asp-Glu-Leu-Leu-Ala)的蛋白質(zhì)，在GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到負調(diào)控的作用。DELLA作為GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵基因，反饋調(diào)節(jié)其上游GA生物合成的相關(guān)基因，同時控制GA通路中的下游基因。在擬南芥中有5個編碼DELLA蛋白的基因，蘋果里中有6個，豌豆中有2個，大麥、水稻、玉米和小麥中各有I個，它們的功能既具有保守性，也具有物種內(nèi)的功能特異性。然而，由于木本植物的研究起步晚，進展慢，雜交鵝掌楸基因組中所編碼的DELLA蛋白的基因數(shù)目還不清楚，其結(jié)構(gòu)和功能都未知。雜交鵝掌楸的生長發(fā)育必然受到受GA的調(diào)節(jié)，因此研究雜交鵝掌楸的DELLA蛋白基因具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的:針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種雜交鵝掌楸LhRGLl基因。本發(fā)明的另一目的是提供雜交鵝掌楸基因在雜種鵝掌楸育種中的應(yīng)用。
[0006]技術(shù)方案:為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下: 一種雜交鵝掌楸基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007]所述的雜交鵝掌楸基因的表達蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008]所述的雜交鵝掌楸基因在雜交鵝掌楸育種中的應(yīng)用。
[0009]含有所述的雜交鵝掌楸基因的載體。
[0010]含有所述的雜交鵝掌楸ZAWfi^基因的宿主細胞。
[0011]有益效應(yīng):與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過對雜交鵝掌楸^基因的克隆與鑒定，基因的表達分析，驗證其功能，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株生長發(fā)育遲緩，植株矮化，分枝數(shù)目增多，可見該基因在植物育種中將有廣泛的用途。
【附圖說明】
[0012]圖1是雜交鵝掌楸的基因的過表達載體圖；
圖2是LhRGLI基因酶切結(jié)果圖，其中，M:DL2000 Marker ；1為LhRGLl與pMD19_TSimple連接后用用BamHI和SacI雙酶切；
圖3是陽性重組子的篩選圖，al為目的引物PCR結(jié)果，條帶大小為1610 bp, a2為35S引物PCR結(jié)果，條帶大小為612 bp;
圖4是轉(zhuǎn)基因陽性植株篩選結(jié)果圖；
圖5是轉(zhuǎn)基因擬南芥植株P(guān)CR結(jié)果圖，圖a，目的引物PCR結(jié)果；圖b，35S引物PCR結(jié)果；M:DL2000 Marker ；CK+:以載體質(zhì)粒DNA為陽性對照；CK:野生型DNA為陰性對照；水:空白對照；
圖6是轉(zhuǎn)LhRGLl T2代植株與野生型擬南芥植株開花時間比較圖，圖中WT，野生型擬南芥；1-4，轉(zhuǎn)LhRGLl基因T2代的不同株系；測量12次，誤差線表示12個重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差；**表示差異極顯著，*表示差異顯著；
圖7是轉(zhuǎn)LhRGLl基因的T2代與野生型COL擬南芥圖；圖中I，2為轉(zhuǎn)LhRGLl驗I 40天的T2代擬南芥植株，col為野生型擬南芥；
圖8是轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥，圖中，LhRGLl為轉(zhuǎn)基因T2代植株，col為野生型擬南芥；
圖9是轉(zhuǎn)^基因植株與野生型植株分枝數(shù)目比較圖，**表示差異極顯著。
【具體實施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明。
[0014]實施例1
本實施例所采用的材料是南京林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)雜交鵝掌楸葉片，采后速凍于液氮中，超低溫冰箱(-80°C)保存。
[0015]I)雜交鵝掌楸葉片總RNA的提取
按照NORGEN植物總RNA提取試劑盒的說明書進行，具體操作為:在處理過的研缽中加入適量的材料及液氮，充分研磨后，加入600 yL LysisSolut1n ;將研缽中裂解后的液體轉(zhuǎn)移至新的離心管中；蓋緊管蓋后，顛倒混勻數(shù)次，在室溫下靜置2 min，使其裂解充分，12000 rpm離心2 min將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中；加入等體積的70%的乙醇，渦旋混勻；將混合液移至試劑盒內(nèi)提供的柱子中(下接2mL的收集管)，12000 rpm離心lmin，棄濾液，將柱子放回收集管上；加入400 μ L的Wash Solut1n，12000 rpm離心lmin，棄濾液，將柱子放回收集管上；向柱子上加入100 μ I的DNase I工作液，14000 rpm離心lmin，將濾液吸回柱子，在23-30°C的水浴鍋或加熱器上靜置15min ;再一次加入400 μ L Wash Solut1n，14000 rpm離心I min，棄濾液；重復(fù)步驟(8);將離心柱放回收集管，14000 rpm離心2 min,棄收集管；將離心柱放入1.5mL的離心管中，加入50 μ L的Elut1n Solut1n。200-2000rpm離心2 min, 14000 rpm離心I min ;所得的RNA樣品，檢測其完整性和純度后，置于_80°C超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0016]吸取2PL RNA在1%瓊脂糖凝膠電泳上進行檢測，結(jié)果顯示28S和18S條帶較為清晰。28S條帶亮度約為18S的兩倍，RNA質(zhì)量較好。用Nonodrop 2000檢測RNA純度，OD26q/OD28。為2.03，OD 26Q/0D23。為2.01，完整性較好，可用于反轉(zhuǎn)錄。
[0017]2)第一鏈cDNA的合成
以所得到的雜交鵝掌楸葉片的總RNA為模板，使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，使用Oligo(dT)作為銷定引物，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。具體操作如下:
在離心管中配制按照下列模板RNA/引物的順序配制混合物，總量為6 μ L:模板2 μ L，Oligo(dT) 12-18 Primer (50 μ Μ) 3 μ L, RNase-free ddH20 lyL。在 PCR 儀上，7(TC 保溫10 min，后迅速將其置于冰上急速冷卻2 min以上。離心數(shù)秒，使得模板RNA/引物的變性溶液聚集于離心管的底部。在上述離心管中配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(1yL):RNA/引物的變性溶液 6 μ L，5 XM-MLV Buffer 2 μ L, dNTP Mixture (10 mM) 0.5 μ L, RNase Inhibitor (40U/μ I) 0.25 μ L，RTase M-MLV (200U/ μ I) 0.5 μ L，Nase-free dH20 0.75 μ L0 PCR 儀上，42°C保溫I h。PCR儀中，70°C保溫15 min，然后置于冰上冷卻，得到cDNA溶液。
[0018]3)目的基因引物的設(shè)計及克隆
根據(jù)現(xiàn)有的雜交鵝掌楸轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，利用其它物種的目關(guān)基因序列進行Blast同源比對。利用01igo7.0，Prime5.0設(shè)計相應(yīng)引物，引物序列為:scf7 180-F:5’-ATCTGCACATCCAAACACACCATTC-3’，scf7 180-R:5’-ACAGCTTATTCTATTGTATCCCGAG-3’。
[0019]以cDNA第一鏈為模板，利用超保真的Phus1n DNA聚合酶進行雜交鵝掌楸基因的克隆。PCR 擴增體系(50 μ L)為:25 μ L 2XPhus1n Master Mix, 2 μ L Forward Primer,2 μ L Reverse Primer, 3 μ L Template DNA，18 μ L Nuclease-free Water0 PCR 程序為:98°C 5 min ；98°C 30 s，57°C 30 s，72°C I min40 s，35 cycles ；72°C 7 min ；4°C forever0
[0020]PCR反應(yīng)完成后，取少量PCR產(chǎn)物(4 μ L左右)進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳后切割目的片段，凝膠回收純化PCR目的擴增產(chǎn)物。采用AXYGEN公司的DNA凝膠回收試劑盒，進行目的片段純化回收，具體操作為:在紫外燈下找到含有目的條帶片段的瓊脂凝膠，用刀片切下后用紙巾吸干表面液體，將其