計，并作為 對照。引物設(shè)計過程為：將DNAJ基因的CDS序列放入PrimerfPlus軟件，產(chǎn)物長度設(shè)為 80-15化P，點(diǎn)擊Pickprimers,選用排在第一位的引物對，序列見表1。將獲取的引物序列 和DNAJ基因的CDS序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)該引物對位于第1個外顯子上，即該引物對擴(kuò)增的 序列全部在第1號外顯子的內(nèi)部。為與步驟（3)中設(shè)計的引物進(jìn)行區(qū)分，將該引物對命名 為ClDNAJ，。
[0024] 圖2為引物ClDNAJ'與CDNA模板結(jié)合及擴(kuò)增示意圖，此時WCDNA為模板擴(kuò)增出 87bp的目標(biāo)片段。圖3為引物ClDNAJ'與基因組DNA模板結(jié)合及擴(kuò)增示意圖，此時擴(kuò)增產(chǎn) 物同樣為87bp的目標(biāo)片段。由此可見，利用當(dāng)前通用的引物設(shè)計方法無法辨別CDNA和基 因組DNA上擴(kuò)增產(chǎn)物的差異。
[00巧](3)利用本發(fā)明中的方法進(jìn)行DNAJ基因的引物設(shè)計：
[0026] 根據(jù)DNAJ基因的結(jié)構(gòu)信息，選取第1、第2個外顯子和之間的內(nèi)含子序列，在軟 件PrimerSPlus(http://www.bioinformatics,nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus. cgiO)上將此內(nèi)含子序列的堿基首尾位置用"□"標(biāo)識，表示前引物位置固定在第I個 外顯子上，后引物位置固定在相鄰的第2個外顯子上，產(chǎn)物長度設(shè)為80-150bp，General Settings設(shè)置為qPCR參數(shù)，點(diǎn)擊Pickprimers,選用排在第一位的引物對，命名為CIDNAJ， 引物序列見表2,沈QNO. 1，SEQNO. 2。
[0027] 圖4為引物ClDNAJ與模板CDNA結(jié)合及擴(kuò)增示意圖，此時正向引物在第1個外顯 子上設(shè)計，反向引物在第2個外顯子上設(shè)計，WCDNA為模板擴(kuò)增出87bp的目標(biāo)片段。圖5 為引物ClDNAJ與基因組DNA模板結(jié)合及擴(kuò)增示意圖，此時擴(kuò)增產(chǎn)物包含內(nèi)含子序列，故在 基因組DNA模板上擴(kuò)增出的片段要大于在CDNA模板上擴(kuò)增出的片段。
[0028] (4)RNA和DNA的提?。?br>[0029] 選取紅飄西瓜授粉后24和30天的果肉樣品為材料，采用Trizol法提取RNA。用 NAN0DR0P2000檢測RNA的濃度和質(zhì)量。RNA的完整性采用2 %的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。 RNA檢測合格后，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。采用CTAB法提取基因組DNA，用NAN0DR0P2000檢測 DNA的濃度和質(zhì)量，分裝保存。
[0030] (5)cDNA的反轉(zhuǎn)錄：
[0031] 反轉(zhuǎn)錄時進(jìn)行去除基因組DNA和不去除基因組DNA兩種處理：
[0032]第一種（不去除基因組DNA):化L總RNA采用PrimeScriptTMRTreagentKitwith 曲NAElraser(TaKaRa)試劑盒直接進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的第二步驟（37°C15min;85°C5s)，形成40ul 的沒有去除基因組DNA的cDNA。用Nano化op2000檢測cDNA的濃度和質(zhì)量，做好記錄，分裝 于200ul離屯、管中于-80°C保存。
[0033]第二種（去除基因組DNA) :2uL總RNA采用PrimeScript?RTreagentKitwith 曲NA化aserCTaKaRa)試劑盒首先進(jìn)行曲NA去除，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（兩步法：42°C2min和 37°C15min;85°C5s)形成 40yL的去除基因組DNA的cDNA。用Nano化op2000 檢測cDNA 的濃度和質(zhì)量，做好記錄，分裝于200ul離屯、管中于-80°C保存。
[0034] 化)DNAJ基因引物的PCR擴(kuò)增特異性檢測：
[0035] 分別WCDNA(分去除基因組DNA和未去除基因組DNA兩種）和基因組DNA為模板， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增特異性檢測。PCR程序?yàn)?5 °C預(yù)變性5min，94°C變性30s、56 °C退火30s、72°C 延伸30s進(jìn)行30個循環(huán)，72°C延伸4min。采用20ul擴(kuò)增體系，包含：1XPCRmix(天根生 化科技有限公司），0. 5umol/L的引物，30ng基因組DNA模板或40化gcDNA模板。PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物用2 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖6。圖6中，C代表WCDNA為模板時PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果；C (g)代表W含有基因組DNA污染的CDNA為模板時PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 的電泳檢測結(jié)果；g代表W基因組DNA為模板時PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果。
[0036] 從圖6得出，采用當(dāng)前通用的引物設(shè)計方法設(shè)計的引物ClDNAJ'在CDNA模板、含 有基因組DNA污染的CDNA為模板和基因組DNA為模板時都擴(kuò)增出了相同大小的目標(biāo)片段， 無法判斷是否存在基因組DNA的污染。而采用本發(fā)明方法設(shè)計的ClDNAJ引物，在CDNA模 板上僅擴(kuò)增出1條帶，在含有基因組DNA污染的CDNA模板上擴(kuò)增出2條帶，其中一條帶和 基因組DNA為模板時擴(kuò)增的條帶大小一致，WCDNA為模板并沒有擴(kuò)增出和基因組DNA大小 一致的條帶，充分表明該CDNA樣品中確實(shí)存在基因組DNA的污染，證明本發(fā)明所使用的方 法對于檢測CDNA樣品中是否存在基因組DNA污染很有效。
[0037] 表1用當(dāng)前通用的引物設(shè)計方法設(shè)計的引物序列
[0039] 表2利用本發(fā)明設(shè)計引物序列
[0040]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測西瓜cDNA樣品中是否有基因組DNA污染的方法，其特征在于： 1) 根據(jù)西瓜基因的結(jié)構(gòu)和序列信息在相鄰兩個外顯子上分別設(shè)計正向和反向引物； 2) 提取西瓜的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后以cDNA為模板，用步驟1)設(shè)計的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并采用瓊脂糖凝膠電泳方法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，如果擴(kuò)增產(chǎn)物中出現(xiàn)一條長于目標(biāo)產(chǎn)物 的片段，則表明cDNA樣品中有基因組DNA的污染，如僅擴(kuò)增出目標(biāo)片段，則表明cDNA樣品 中無基因組DNA的污染。2. -種利用西瓜DNAJ基因檢測西瓜果實(shí)cDNA樣品中是否有基因組DNA污染的方法， 其特征包括以下步驟： 1) 根據(jù)西瓜DNAJ基因的結(jié)構(gòu)和序列信息在第1和第2兩個相鄰?fù)怙@子上分別設(shè)計正 向和反向引物； 2) 提取西瓜的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后以cDNA為模板，用步驟1)設(shè)計的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并采用瓊脂糖凝膠電泳方法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。如果擴(kuò)增產(chǎn)物中出現(xiàn)一條長于87bp的片 段，則表明cDNA樣品中存在有基因組DNA的污染，如僅擴(kuò)增出87bp的片段，則表明cDNA樣 品中無基因組DNA污染。3. 如權(quán)利要求2所述的利用西瓜DNAJ基因檢測果實(shí)cDNA樣品中是否有基因組DNA污 染的方法，其特征在于： 所述正向和反向引物的核苷酸序列分別是： 正向引物序列：CCGCTATCAAGAACCATCCT 反向引物序列：CTGGATCACTCAGCACCTCA。
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因表達(dá)分析技術(shù)領(lǐng)域，是一種西瓜基因表達(dá)分析時，檢測cDNA樣品中是否存在基因組DNA污染的方法。本發(fā)明的原理是根據(jù)基因的結(jié)構(gòu)和序列信息，在相鄰的兩個外顯子上分別設(shè)計正向和反向引物，使之在基因組DNA模板上擴(kuò)增產(chǎn)物大于在cDNA模板上的擴(kuò)增產(chǎn)物。據(jù)此原理設(shè)計了西瓜中廣泛存在的分子伴侶DnaJ蛋白基因DNAJ的特異性引物，以樣品cDNA為模板，利用該引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如出現(xiàn)大于87bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，則表明該cDNA樣品存在基因組DNA污染，如僅出現(xiàn)87bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，則表明該cDNA樣品不存在基因組DNA的污染。使用本發(fā)明所提供的方法，可以進(jìn)一步提高利用實(shí)時熒光定量PCR等技術(shù)進(jìn)行西瓜基因表達(dá)分析的準(zhǔn)確性。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105219861
【申請?zhí)枴緾N201510678873
【發(fā)明人】別之龍, 孔秋生, 曹蕾, 高凌云, 劉朋, 劉越
【申請人】華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年1月6日
【申請日】2015年10月19日