Ccdc59的激動(dòng)劑在制備骨性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體設(shè)及CCD巧9的激動(dòng)劑在制備骨性關(guān)節(jié)炎藥物中 的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis,OA)是中老年人最常見的疾病之一，由于人群預(yù)期 壽命的延長(zhǎng)，骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率也明顯增高，尤其是肥胖的老年人群，60歲W上人群中， 50 %W上在X線上有骨性關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)。其常見病理改變?yōu)檐浌窍鹿怯不?、關(guān)節(jié)周圍骨寶形 成、慢性滑膜炎，其引起的疼痛、功能障礙嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。
[0003] 現(xiàn)有的骨性關(guān)節(jié)炎治療方法包括運(yùn)動(dòng)、藥物、休息和關(guān)節(jié)保健、手術(shù)、疼痛緩解技 術(shù)、替代治療和體重控制。治療骨性關(guān)節(jié)炎中常用的藥物包括非醬族抗炎藥如阿司匹林、布 洛芬等；直接用于皮膚的局部疼痛緩解乳膏、橡膠和噴霧劑等?？蛇M(jìn)行手術(shù)W使骨表面重 建、骨復(fù)位和置換關(guān)節(jié)。盡管各種藥物療法已被用于治療疾病，但是它們對(duì)長(zhǎng)期控制和預(yù) 防是無效的。近年來研究發(fā)現(xiàn)在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展的過程中多種細(xì)胞因子參與其病 理過程并起到非常重要的作用。參與骨性關(guān)節(jié)炎的細(xì)胞因子主要分為分解代謝相關(guān)細(xì)胞因 子、合成代謝相關(guān)細(xì)胞因子、炎性因子及一氧化氮、類花生酸類物質(zhì)等其他細(xì)胞因子。運(yùn)些 祀標(biāo)的發(fā)現(xiàn)為骨性關(guān)節(jié)炎的治療提供了新思路。
[0004] 發(fā)明人對(duì)7例骨性關(guān)節(jié)炎滑膜組織及4例對(duì)照樣本進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)合生物信 息學(xué)方法進(jìn)行基因篩選，挑選出候選基因CCD巧9,現(xiàn)有研究中并沒有CCDC59和骨性關(guān)節(jié)炎 相關(guān)的報(bào)道，進(jìn)一步，發(fā)明人進(jìn)行了分子生物學(xué)方法驗(yàn)證，證實(shí)了CCDC59在骨性關(guān)節(jié)炎組 織中低表達(dá)，其激動(dòng)劑可用于制備治療骨性關(guān)節(jié)炎藥物。本發(fā)明提供了一種新的骨性關(guān)節(jié) 炎的治療祀點(diǎn)，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種骨性關(guān)節(jié)炎診斷制劑，所述骨性關(guān)節(jié)炎診斷制劑檢測(cè) CCDC59基因和/或基因的表達(dá)產(chǎn)物。進(jìn)一步的，所述的CCDC59基因和/或基因的表達(dá)產(chǎn)物 在骨性關(guān)節(jié)炎組織中低表達(dá)。
[0006] 進(jìn)一步，所述骨性關(guān)節(jié)炎診斷制劑采用巧光定量PCR試劑盒、基因忍片、免疫方法 檢測(cè)骨性關(guān)節(jié)炎組織中CCDC59基因的表達(dá)。優(yōu)選的，所述的巧光定量PCR試劑盒中含有一 對(duì)特異性擴(kuò)增CCDC59基因的引物；所述的基因忍片中包括與CCDC59基因的核酸序列雜交 的探針。更優(yōu)選的，巧光定量PCR試劑盒內(nèi)含有特異性檢測(cè)CCDC59基因的上游引物和下游 引物，上游引物序列為SEQIDNO. 1，下游引物序列為SEQIDNO. 2。
[0007] 進(jìn)一步，所述的骨性關(guān)節(jié)炎的診斷制劑采用免疫方法檢測(cè)骨性關(guān)節(jié)炎滑膜組織中 CCDC59基因的表達(dá)產(chǎn)物。優(yōu)選的，所述免疫方法為化ISA檢測(cè)和/或膠體金檢測(cè)。進(jìn)一步， 所述檢測(cè)CCDC59蛋白的ELISA法為使用ELISA檢測(cè)試劑盒。所述試劑盒中的抗體可采用市 售的CCDC59單克隆抗體或多克隆抗體。進(jìn)一步，所述的試劑盒包括：包被CCDC59抗體的固 相載體，酶標(biāo)抗體，酶的底物，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對(duì)照品，稀釋液，洗涂液，酶反應(yīng)終止液等。 [000引進(jìn)一步，所述檢測(cè)CCDC59蛋白的膠體金法為使用檢測(cè)試劑盒，所述的抗體可采用 市售的CCDC59單克隆抗體或多克隆抗體。進(jìn)一步，所述的膠體金檢測(cè)試劑盒采用膠體金免 疫層析技術(shù)或膠體金滲濾法。進(jìn)一步，所述的膠體金檢測(cè)試劑盒硝酸纖維素膜上的檢測(cè)區(qū) (T)噴點(diǎn)有抗CCDC59抗體、質(zhì)控區(qū)（C)噴點(diǎn)有免疫球蛋白IgG。
[0009] 本發(fā)明的目的在于提供上述骨性關(guān)節(jié)炎診斷制劑在制備骨性關(guān)節(jié)炎診斷工具中 的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的目的在于提供一種治療骨性關(guān)節(jié)炎的制劑，所述制劑中含有促進(jìn)CCD巧9 基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的試劑或化合物。進(jìn)一步的，所述的CCDC59基因和/或基因的表達(dá)產(chǎn)物 在骨性關(guān)節(jié)炎組織中低表達(dá)。
[0011] 本領(lǐng)域人員熟知促進(jìn)基因及其表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)通?？蒞采用下述方法中的一種 和/或幾種：激活分子標(biāo)志物的啟動(dòng)子、激活分子標(biāo)志物表達(dá)的蛋白或因子、導(dǎo)入促進(jìn)分子 標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的載體。
[0012] 優(yōu)選的，所述治療骨性關(guān)節(jié)炎的制劑中含有促進(jìn)CCDC59基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的載 體和/或激活CCDC59基因的啟動(dòng)子和/或激活CCDC59基因表達(dá)的蛋白或因子。
[0013] 本發(fā)明的目的在于提供上述治療骨性關(guān)節(jié)炎的制劑在制備骨性關(guān)節(jié)炎治療藥物 或試劑中的應(yīng)用。
[0014] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先通過高通量測(cè)序結(jié)合生物信息學(xué)方法篩選到候選基 因CCD巧9基因，進(jìn)而通過分子生物學(xué)方法驗(yàn)證了CCD巧9基因與骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)系：CCD巧9 基因與骨性關(guān)節(jié)炎具有很好的相關(guān)性，可用于制備骨性關(guān)節(jié)炎輔助診斷制劑，具有重要的 臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0015] 巧光定量PCR法是通過巧光染料或巧光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo) 記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可W對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板 的初始濃度。巧光定量PCR的出現(xiàn)，極大地簡(jiǎn)化了定量檢測(cè)的過程，而且真正實(shí)現(xiàn)了絕對(duì)定 量。多種檢測(cè)系統(tǒng)的出現(xiàn)，使實(shí)驗(yàn)的選擇性更強(qiáng)。自動(dòng)化操作提高了工作效率，反應(yīng)快速、 重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果清晰。
[0016] 基因忍片又稱為DNA微陣列值NAmicroarray)，可分為S種主要類型：1)固定在 聚合物基片（尼龍膜，硝酸纖維膜等）表面上的核酸探針或CDNA片段，通常用同位素標(biāo)記 的祀基因與其雜交，通過放射顯影技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。2)用點(diǎn)樣法固定在玻璃板上的DNA探針 陣列，通過與巧光標(biāo)記的祀基因雜交進(jìn)行檢測(cè)。3)在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核巧 酸探針陣列，與巧光標(biāo)記的祀基因雜交進(jìn)行檢測(cè)?；蛉唐鳛橐环N先進(jìn)的、大規(guī)模、高通 量檢測(cè)技術(shù)，應(yīng)用于疾病的診斷，其優(yōu)點(diǎn)有W下幾個(gè)方面：一是高度的靈敏性和準(zhǔn)確性；二 是快速簡(jiǎn)便；=是可同時(shí)檢測(cè)多種疾病。
[0017] 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)巧LISA)即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo) 記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行的技術(shù)。該技術(shù)可用于檢測(cè)大分子抗原和特異性抗體 等，具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。ELISA檢測(cè)試劑盒根據(jù)檢測(cè)目的和操作 步驟可分為間接法、雙抗夾屯、法、競(jìng)爭(zhēng)法、雙位點(diǎn)一步法、捕獲法測(cè)IgM抗體、應(yīng)用親和素和 生物素的化ISA。ELISA檢測(cè)試劑盒中生色底物可選擇辣根過氧化物酶（HR巧或者堿性憐 酸酶（AF0。
[0018] 常用的免疫膠體金檢測(cè)技術(shù)：（I)免疫膠體金光鏡染色法細(xì)胞懸液涂片或組織切 片，可用膠體金標(biāo)記的抗體進(jìn)行染色，也可在膠體金標(biāo)記的基礎(chǔ)上，W銀顯影液增強(qiáng)標(biāo)記， 使被還原的銀原子沉積于已標(biāo)記的金顆粒表面，可明顯增強(qiáng)膠體金標(biāo)記的敏感性。（2)免疫 膠體金電鏡染色法可用膠體金標(biāo)記的抗體或抗抗體與負(fù)染病毒樣本或組織超薄切片結(jié)合， 然后進(jìn)行負(fù)染。可用于病毒形態(tài)的觀察和病毒檢測(cè)。（3)斑點(diǎn)免疫金滲濾法應(yīng)用微孔濾膜 作載體，先將抗原或抗體點(diǎn)于膜上，封閉后加待檢樣本，洗涂后用膠體金標(biāo)記的抗體檢測(cè)相 應(yīng)的抗原或抗體。（4)膠體金免疫層析法將特異性的抗原或抗體W條帶狀固定在膜上，膠 體金標(biāo)記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本 墊上后，通過毛細(xì)作用向前移動(dòng)，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，當(dāng)移動(dòng)至固 定的抗原或抗體的區(qū)域時(shí)，待檢物與金標(biāo)試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留， 聚集在檢測(cè)帶上，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。該法現(xiàn)已發(fā)展成為診斷試紙條，使用十分方 便。
[0019] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)骨性關(guān)節(jié)炎的基因檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒檢測(cè) 基因CCD巧9,采用特異的上游引物和下游引物，上游引物序列為SEQIDNO. 1，下游引物序 列為沈QIDNO. 2。
[0020] 進(jìn)一步，該P(yáng)CR試劑盒適合于目前存在市場(chǎng)上的所有類型巧光定量基因擴(kuò)增儀， 靈敏度高，定量快速準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好，具有良好的應(yīng)用前景。
[002。 進(jìn)一步，上述巧光定量PCR試劑盒組分包括：特異性引物、內(nèi)參引物、巧光定量PCR反應(yīng)液。所述內(nèi)參為GAPDH。
[0022] 所述的試劑盒還包含RNA抽提試劑。
[0023] 本發(fā)明目的是提供了一種骨性關(guān)節(jié)炎蛋白檢測(cè)試劑盒，所述的檢測(cè)試劑盒檢測(cè) CCDC59蛋白。進(jìn)一步的，所述的試劑盒還包括其他檢測(cè)試劑。
[0024] 本發(fā)明目的是提供了一種檢測(cè)骨性關(guān)節(jié)炎的基因忍片，所述的基因忍片包括與 CCDC59基因的核酸序列雜交的探針。
【附圖說明】
[0025] 圖1Westernblot測(cè)定滑膜組織中C