重組多肽生產(chǎn)的制作方法
【專利說明】重組多化生產(chǎn) 1.發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及重組多膚的生產(chǎn)。更具體而言，本發(fā)明設(shè)及調(diào)節(jié)miRNA來提高產(chǎn)生重 組多膚的細(xì)胞系的生產(chǎn)率，例如通過提高或降低一個(gè)或多個(gè)miRNA的水平。
[0002] 2.背景
[0003] 培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞經(jīng)常用于產(chǎn)生重組多膚。哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)提供優(yōu)于非哺乳 動(dòng)物系統(tǒng)的許多優(yōu)點(diǎn)，包括例如恰當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)折疊、組裝W及翻譯后修飾。然而，在提高大 規(guī)模哺乳動(dòng)物培養(yǎng)物的生產(chǎn)率的方面仍然存在挑戰(zhàn)，包括例如與生長水平、細(xì)胞應(yīng)激、W及 翻譯速率有關(guān)的挑戰(zhàn)。在許多工業(yè)細(xì)胞培養(yǎng)過程中，在大型生物反應(yīng)器中作為混懸液高密 度地培養(yǎng)細(xì)胞，并且細(xì)胞往往會(huì)增殖超過它們的最優(yōu)生長條件。在運(yùn)些條件下，可能會(huì)觸發(fā) 細(xì)胞調(diào)亡，并且因此細(xì)胞活力和生產(chǎn)率可能會(huì)降低。因此，許多生產(chǎn)優(yōu)化策略依賴于防止細(xì) 胞調(diào)亡，并且通過增強(qiáng)培養(yǎng)基配制和生長條件來改變細(xì)胞代謝。最近研究表明細(xì)胞生產(chǎn)率 可W通過改變調(diào)節(jié)多個(gè)重要細(xì)胞路徑的關(guān)鍵分子如轉(zhuǎn)錄因子的全基因表達(dá)模式來提高。
[0004] 微小RNA(miRNA)是在植物和動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的具有約22個(gè)核巧酸的小的非編碼的 RNA分子，并且是基因表達(dá)的關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)劑。miRNA通過與mRNA分子內(nèi)的互 補(bǔ)序列進(jìn)行堿基配對來起作用，從而經(jīng)常導(dǎo)致基因沉默，并且運(yùn)些miRNA設(shè)及動(dòng)物和植物 體內(nèi)包括與細(xì)胞生長、發(fā)育W及分化相關(guān)的調(diào)節(jié)功能的各種生物路徑。miRNA在維持細(xì)胞內(nèi) 環(huán)境穩(wěn)定和調(diào)節(jié)重要細(xì)胞路徑如生長和細(xì)胞調(diào)亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。不合適的miRNA表達(dá)與 包括癌癥的多種疾病相關(guān)聯(lián)，在運(yùn)些疾病中，它們可能通過同時(shí)改變眾多蛋白質(zhì)和路徑而 形成發(fā)病機(jī)理。 陽0化]單個(gè)miRNA改變影響多個(gè)生理過程的能力表明修飾生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物中的miRNA表 達(dá)可W延遲生產(chǎn)性細(xì)胞生長期，產(chǎn)生較高的抗體滴度并且提高生產(chǎn)率（辛普森（Sampson) 等人，（2007)"微小RNALet-7a下調(diào)MYC并且使MYC誘導(dǎo)的伯基特氏淋己瘤細(xì)胞的生長 恢復(fù)原狀（MicroRNALet_7adown-regulatesMYCandrevertsMYC-inducedgrowth inBurkittLymphomacells.)"癌癥研究（CancerRes)67(20) :9762-9770;穆勒 (Muller)等人，（2008)"作為用于使CHO細(xì)胞工廠工程化的祀標(biāo)的微小RNA(MicroRNAs astargetsforengineeringofCHOcellfactories.) ^ 生物技術(shù)趨勢（Trendsin Biotechnology) 26 (7) :359-365 ;W及己倫度arron)等人，（2011)"通過miR-7 的過表達(dá)來 使CHO細(xì)胞生長和重組多膚生產(chǎn)工程化巧ngineeringCHOcellgrowthandrecombinant polypeptideproductivitybyoverexpressionofmiR-7.) 物技術(shù)雜志（Journalof Biotechnology) 151 (2) :204-11)。因此，研究人員已開始考察微小RNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培 養(yǎng)物中的作用，運(yùn)主要是通過內(nèi)源性miRNA在整個(gè)生產(chǎn)培養(yǎng)過程中發(fā)生的改變的分析來進(jìn) 行（穆勒等人，（2008)"作為用于使Cffi)細(xì)胞工廠工程化的祀標(biāo)的微小RNA"生物技術(shù)趨勢 26(7) :359-365;己倫等人，（2011)"通過miR-7的過表達(dá)來使C冊細(xì)胞生長和重組多膚生 產(chǎn)工程化"生物技術(shù)雜志151(2) :204-11 ;甘默爾（Gammell)等人，（2007)"混懸液CHO-Kl 細(xì)胞中的miRNA表達(dá)的低溫和培養(yǎng)階段誘導(dǎo)的初始鑒別（Initialidentificationof lowtemperatureandculturestageinductionofmiRNAexpressioninsuspension CHO-Klcells.)"生物技術(shù)雜志130:213-218;?及哈克爾（Hackl)等人，（2010)"中國倉 鼠卵巢微小RNA轉(zhuǎn)錄組的新一代測序：作為用于細(xì)胞工程化的祀標(biāo)的微小RNA的鑒別、注釋 U及音1]析（Next-邑ener曰tionsequencin邑oftheChinesehamsterov曰rymicroRNAtr曰 nscriptome:Identific曰tion,曰nnot曰tion曰ndprofilingofmicroRNAs曰stargetsfor cellularengineering.)"生物技術(shù)雜志153(1-2) :62-75)。少數(shù)研究還探索了異位表達(dá) 的miR或抗miR對CHO細(xì)胞的影響（己倫等人2011 ;米尼迪（Meleady)等人2011 ;德魯茲 值ruz)等人2011)。然而，C冊細(xì)胞中改變的miRNA的效果的更精細(xì)的表征在運(yùn)項(xiàng)技術(shù)可 W按常規(guī)實(shí)施來提高治療用生物制劑的生產(chǎn)之前是必要的。
[0006] 3.概沐 陽007] 在此披露了一種在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生重組多膚的方法，在該哺乳動(dòng) 物細(xì)胞培養(yǎng)物中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有降低的miRNA-let-7a活性。在一個(gè)實(shí)施例中，miRNA-let-7a活性被微小RNA抑制劑降低。在一個(gè)實(shí)施例中，微小RNA抑制劑包括 miRNA-let-7a的反義寡核巧酸抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物包括用 miRNA-let-7a的合成的反義寡核巧酸抑制劑轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，寡 核巧酸抑制劑被化學(xué)修飾來改進(jìn)核酸酶抗性，通過RISC提高對miRNA引導(dǎo)的裂解的抗性 和/或提高結(jié)合親和力。在一個(gè)實(shí)施例中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物包括用編碼miRNA-let-7a 的反義寡核巧酸抑制劑的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物可W用 miRNA-let-7a的反義寡核巧酸抑制劑穩(wěn)定地或瞬時(shí)地轉(zhuǎn)染。在另一個(gè)實(shí)施例中，哺乳動(dòng)物 細(xì)胞包括miRNA-let-7a基因敲除。
[000引適合的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括但不限于：例如，中國倉鼠卵巢（CHO)細(xì)胞、小鼠骨髓瘤 (NSO)、人胚腎（肥K293和衍生物如293TJ93H)、幼倉鼠腎度HK)細(xì)胞、非洲綠猴腎細(xì)胞 (Verocells)、人子宮頸癌傳代細(xì)胞化eLacells)、馬下達(dá)比犬腎（MDCK)細(xì)胞、CVl猴腎細(xì) 胞、3T3細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞系、PC12、WI38細(xì)胞、猴腎成纖維細(xì)胞的C0S-7系、W及C127。
[0009] 適合的重組多膚包括抗體或它的結(jié)合片段W及非抗體蛋白。在一個(gè)實(shí)施例中，抗 體或它的結(jié)合片段選自多特異性抗體、完全的人抗體、人源化抗體、駱駝化抗體（camelised antibodies)、嵌合抗體、CDR移植抗體、單鏈Fvs(scFv)、二硫鍵連接的Fvs(sdFv)、F油片 段、F(油'）片段、W及抗獨(dú)特型（抗Id)抗體。在一個(gè)實(shí)施例中，抗體或它的結(jié)合片段包括 選自IgG、I姐、IgM、I曲、IgAW及I巧的同種型。在另一個(gè)實(shí)施例中，抗體包括選自IgGU IgG2、IgGSW及IgG4的同種型。
[0010] 在另一個(gè)實(shí)施例中，重組多膚包括非抗體蛋白。在一個(gè)實(shí)施例中，重組多膚包括融 合蛋白。在另一個(gè)實(shí)施例中，重組多膚包括受體。在一個(gè)實(shí)施例中，重組多膚包括細(xì)胞表面 蛋白的配體。在另一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞表面蛋白是受體。在另一個(gè)實(shí)施例中，重組多膚包括 分泌的蛋白。在另一個(gè)實(shí)施例中，重組多膚包括酶。在另一個(gè)實(shí)施例中，重組多膚包括支架 模擬物。
[0011] 在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞培養(yǎng)物具有與不具有降低的miRNA-let-7a活性的對照細(xì) 胞培養(yǎng)物相比較增加至少約25 %的比生產(chǎn)率。在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞培養(yǎng)物具有在峰值 活細(xì)胞密度（VCD)下確定的，與不具有降低的miRNA-let-7a活性的對照細(xì)胞培養(yǎng)物相 比較時(shí)增加至少約25%的最大生產(chǎn)率。在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞培養(yǎng)物在與不具有降低的 miRNA-let-7a活性的對照細(xì)胞培養(yǎng)物相比較細(xì)胞培養(yǎng)物中的每個(gè)活細(xì)胞的抗體滴度增加 情況下具有提高的比生產(chǎn)率。
[0012] 在一個(gè)實(shí)施例中，在與不具有降低的miRNA-let-7a活性的對照細(xì)胞培養(yǎng)物相比 較時(shí)，細(xì)胞調(diào)亡、蛋白質(zhì)翻譯或細(xì)胞代謝中的至少一個(gè)介導(dǎo)因子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中 的表達(dá)增加。在一個(gè)實(shí)施例中，在與不具有降低的miRNA-let-7a活性的對照細(xì)胞培養(yǎng)物相 比較時(shí)，選自HMGA2、MYC、NF2、NIRF、RAB40CW及eIF4a的miRNA-let-7a的至少一個(gè)祀標(biāo) 在細(xì)胞培養(yǎng)物中的表達(dá)增加。
[0013] 在一個(gè)實(shí)施例中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞與對照細(xì)胞培養(yǎng)物相比較具有選自miR-lOa、 miR-21W及它們的組合的第二微小RNA的增加的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞用 能夠表達(dá)miR-10a、miR-21或它們的組合的表達(dá)載體來轉(zhuǎn)染。在一個(gè)實(shí)施例中，哺乳動(dòng)物細(xì) 胞具有選自miR-16、miR-101、miR-145W及它們的組合的第二微小RNA的降低的活性。在 一個(gè)實(shí)施例中，第二微小RNA的活性被第二微小RNA抑制劑降低。在一個(gè)實(shí)施例中，第二微 小RNA抑制劑包括反義寡核巧酸抑制劑。在一個(gè)實(shí)施例中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物包括用第 二反義寡核巧酸抑制劑轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，第二寡核巧酸抑制劑被化 學(xué)修飾來改進(jìn)核酸酶抗性，通過RISC提高對miRNA引導(dǎo)的裂解的抗性和/或提高結(jié)合親和 力。在一個(gè)實(shí)施例中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物包括用編碼第二反義寡核巧酸抑制劑的表達(dá)載 體轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0014] 還披露了被配置成表達(dá)重組多膚的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞系具有 降低的miRNA-let-7a活性；表達(dá)系統(tǒng)，運(yùn)些表達(dá)系統(tǒng)包括編碼miRNA-let-7a的反義微 小RNA抑制劑的一個(gè)或多個(gè)載體W及編碼重組蛋白的核巧酸序列；細(xì)胞培養(yǎng)基，運(yùn)些細(xì) 胞培養(yǎng)基包括miRNA-let-7a的反義抑制劑；W及重組多膚，運(yùn)些重組多膚產(chǎn)生自包括用 miRNA-let-7a的反義微小RNA抑制劑轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0015] 4.附圖簡要說巧
[0016] 圖1是示出按滴度/累積VCD的積分計(jì)算且記錄為mg/L/累積細(xì)胞天數(shù)（CCD)的 試驗(yàn)結(jié)束比生產(chǎn)率（runspecificproductivity)(Qp)的圖。
[0017] 圖2是示出累積Qp與最大QP比較的圖。
[0018] 圖3是示出每兩天測量的抗miR-let-7a、抗miR-143 W及miR-lOa修飾的CHO細(xì) 胞系的重組抗體滴度（相對于第2天測量的基線水平）的圖。
[0019] 圖4是示出每兩天測量的抗miR-let-7a、抗miR-143 W及miR-lOa修飾的CHO細(xì) 胞系的VCD(相對于第0天測量的基線水平）的圖。
[0020] 圖5是示出用抗miR-let-7a慢病毒載體或載體對照轉(zhuǎn)導(dǎo)的親本培養(yǎng)物的分批進(jìn) 料測定過程中測量的兩種抗體產(chǎn)生細(xì)胞系的相對VCD的圖。結(jié)果示出為相對VCD水平對比 基線（第0天）。
[0021] 圖6是示出每兩天評(píng)價(jià)的抗miR-let-7a修飾的培養(yǎng)物和對照的重組抗體滴度 (相對于第2天測量的基線）的圖。
[0022] 圖7是在產(chǎn)生重組HiAb的兩個(gè)細(xì)胞系中相對于對照累積化呈％增加的表。
[0023] 圖8是示出在miR-let-7a的抑制之后與對照系相比較的miR或抗miR修飾的細(xì) 胞系中通過化qMan定量PCR評(píng)價(jià)的C冊生產(chǎn)細(xì)胞中的多個(gè)mRNA祀標(biāo)的成倍變化的圖。條 形圖表示平均值±SD。
[0024] 圖9A和圖9B. (A)示出光密度測量用于計(jì)算在miR-let-7a的抑制之后與對照相 比較的RAS/GAPDH比的變化％。度）是示出親本、對照W及抗miR-let-7a細(xì)胞系中的RAS和負(fù)載對照GAPDH的蛋白質(zhì)水平的蛋白質(zhì)印跡法。
[00巧]圖10是示出祀基因參與多個(gè)細(xì)胞路徑的流程圖，運(yùn)些細(xì)胞路徑包括因抗體產(chǎn)生 細(xì)胞系中的miR-let-7a的調(diào)控而改變的增殖/細(xì)胞周期、細(xì)胞調(diào)亡、應(yīng)激抗性、代謝和轉(zhuǎn)錄 /翻譯。
[0026] 圖11A-C. (A)是用表達(dá)抗miR和GFP的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的C冊細(xì)胞的代表性顯微 照片，該代表性顯微照片指示了接近100%的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。度）和（C)是示出用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的 CHO細(xì)胞與親本細(xì)胞相比較巧光值（RF巧出現(xiàn)2log位移的代表性FACS直方圖。
[0027] 圖12A和圖12B是W下各項(xiàng)的代表性去卷積ESI質(zhì)譜：來自親本系的代表性單克 隆抗體-減少的肥和LC質(zhì)量，LC22895. 9263匹配LC和肥(GOF) ,50992. 2014匹配GOF; 51154. 2639匹配GlF;和51316. 1579匹配G2F;W及度）來自抗miR-let-7a修飾的系的 抗體-減少的肥和LC質(zhì)量，LC22895. 7493匹配LC和肥(GOF) ,50992. 7636匹配GOF和 51154. 3954 匹配GIF。
[0028] 5.詳細(xì)說巧
[0029]A.綜沐
[0030] 在此描述的本發(fā)明的實(shí)施例設(shè)及用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生重組多膚的 方法。在一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括在微小RNA的存在下培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞W提高細(xì)胞系 生產(chǎn)率。在一個(gè)更具體的實(shí)施例中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞系可W被工程化來改變微小RNA活性W 便提高重組多膚生產(chǎn)率。
[0031]B.定女
[0032] 除非另外定義，在此使用的科學(xué)術(shù)語和技術(shù)術(shù)語應(yīng)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍 理解的含義。另外，除非上下文另有要求，單數(shù)術(shù)語應(yīng)包括復(fù)數(shù)形式，并且復(fù)數(shù)術(shù)語應(yīng)包括 單數(shù)形式。一般而言，結(jié)合在此描述的細(xì)胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、W及蛋白質(zhì)和寡核巧 酸或多核巧酸化學(xué)連同雜交使用的術(shù)語和它們的技術(shù)都是本領(lǐng)域熟知的和普遍使用的。
[0033] 標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于重組DNA、寡核巧酸合成W及組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化（例如，電穿孔、脂轉(zhuǎn) 染、病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)）。酶促反應(yīng)和純化技術(shù)是根據(jù)制造商的說明書或本領(lǐng)域常規(guī)實(shí)行方法或如在 此所述進(jìn)行。運(yùn)些技術(shù)和程序通常是根據(jù)本領(lǐng)域中熟知的常規(guī)方法和貫穿本說明書中引用 且論述的各種通用和更特定的參考文獻(xiàn)中所述來進(jìn)行。參見例如，桑布洛克（Sambrook)等 人，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊（Mole州IarCloning=AL油oratoryManual)(第3版，冷泉港實(shí) 驗(yàn)室出版社（ColdSpringHarborL油oratoryPress),冷泉港，紐約（2001))，該實(shí)驗(yàn)室手 冊通過引用結(jié)合在此。結(jié)合在此描述的分析化學(xué)、合成有機(jī)化學(xué)、W及醫(yī)學(xué)和藥物化學(xué)使用 的術(shù)語，它們的實(shí)驗(yàn)室方法和技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的和普遍使用的。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于化學(xué)合成， 化學(xué)分析，藥物制備、配制W及遞送，例如W用于治療患者。
[0034] 如根據(jù)本披露所使用，除非另外指明，W下術(shù)語應(yīng)理解為具有W下含義：
[0035] 如在此所使用，術(shù)語"約"用于修飾例如在描述本發(fā)明中采用的組合物中成分的數(shù) 量、濃度、體積、工藝溫度、工藝時(shí)間、產(chǎn)率、流速、壓力W及它們的范圍。術(shù)語"約"指代數(shù)量 的變化，運(yùn)種變化例如通過制備化合物、組合物、濃縮物或使用配制品所使用的典型的測量 和處理程序、通過在運(yùn)些程序中無意中犯的錯(cuò)誤、通過執(zhí)行方法所使用的起始材料或成分 的制備、來源或純度的差異W及其他類似考慮導(dǎo)致可能發(fā)生。術(shù)語"約"還涵蓋因配制品的 老化而與具體起始濃度或混合物不同的量，W及因混合或處理配制品而與具體起始濃度或 混合物不同的量。當(dāng)利用術(shù)語"約"修飾時(shí)，在此隨附的權(quán)利要求書包括運(yùn)些等效量。
[0036] 如在此所使用，術(shù)語"抗體"指代包括通過多膚鏈的折疊形成的至少一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu) 域的多膚或一群多膚，運(yùn)些多膚鏈具有=維結(jié)合空間，其中內(nèi)表面形狀和電荷分布與抗原 的抗原決定簇的特征互補(bǔ)。抗體典型地具有四聚體形式，包括兩對相同的多膚鏈，每對具有 一個(gè)"輕"鏈和一個(gè)"重"鏈。每個(gè)輕