。
[0043]在其他實(shí)施方案中，尿液樣品的分析可包括雜交、循環(huán)探針反應(yīng)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、分析單鏈構(gòu)象多態(tài)性的PCR、連接酶鏈反應(yīng)、鏈置換擴(kuò)增或分析限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性的PCR以及測(cè)序核酸分子的任何方法。
[0044]在另外的實(shí)施方案中，可減少尿液樣品中的核酸降解。減少核酸降解可包括通過增加的pH、增加的鹽濃度、熱滅活或通過用選自由乙二胺四乙酸、鹽酸胍異硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸或十二烷基硫酸鈉組成的組的化合物處理所述尿液樣品抑制核酸酶活性。在其他實(shí)施方案中，用離液鹽處理核酸。在許多情況下，尿液樣品已經(jīng)在膀胱中保持少于12小時(shí)。
[0045]可任選地通過使尿液樣品與固體物質(zhì)諸如吸附TR-NA的樹脂接觸進(jìn)行TR-NA與尿液中的細(xì)胞的分離。在一些情況下，可洗滌、沖洗或洗脫物質(zhì)以去除細(xì)胞和與細(xì)胞相關(guān)的核酸。洗滌、沖洗或洗脫還可有利地將TR-NA與如本文所描述的較大核酸分離。在一些實(shí)施方案中，分離可包括基本上分離感興趣的TR-NA。在一些情況下，分離可通過沉淀或使用固體吸附劑物質(zhì)。在其他情況下，分離可以通過過濾尿液樣品以去除細(xì)胞和與細(xì)胞相關(guān)的核酸和/或其他污染物。任選地，過濾可以是與TR-NA結(jié)合的固相材料的過濾。在一些情況下，過濾去除細(xì)胞和包含大于約1000個(gè)核苷酸或大于約300個(gè)核苷酸的核酸。
[0046]附圖簡(jiǎn)述
[0047]圖1圖解了用于檢測(cè)在人BRAF中的V600E突變的引物排列。示出了用于測(cè)定1_4的引物對(duì)。
[0048]圖2圖解了用于檢測(cè)在人BRAF中的V600K突變的引物排列。示出了用于測(cè)定10-14的引物對(duì)。
[0049]圖3示出了來自測(cè)定1-4實(shí)時(shí)PCR的結(jié)果。
[0050]圖4示出了來自測(cè)定10和11實(shí)時(shí)PCR的結(jié)果。
[0051]圖5示出了來自測(cè)定12-14實(shí)時(shí)PCR的結(jié)果。
[0052]實(shí)踐本公開內(nèi)容的方式詳述
[0053]本公開內(nèi)容提供了用于分析尿液樣品中的無細(xì)胞跨腎核酸的多種方法。
[0054]本發(fā)明包括尿液中癌癥相關(guān)基因序列的分析或檢測(cè)。非限制性實(shí)例包括如技術(shù)人員所知的K-RAS、NPMU BRAF和SF3B1及其突變體。
[0055]用標(biāo)準(zhǔn)的基于二氧化硅的方法從尿液中分離的DNA由兩個(gè)級(jí)分組成，來源于脫落細(xì)胞的高分子量DNA和低分子量(150-250個(gè)堿基對(duì))TR-DNA級(jí)分(Botezatu等人，ClinChem.46:1078-1084，2000 ;和 Su 等人，J Mol.Diagn.6:101-107，2004)。用于從體液分離無細(xì)胞核酸到分離跨腎核酸的最近的技術(shù)揭示了尿液中存在遠(yuǎn)少于150個(gè)堿基對(duì)的DNA和RNA片段(美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)20080139801)。美國(guó)公開20100068711報(bào)道了擴(kuò)增20-50個(gè)堿基對(duì)的“超短"PCR靶以具有足夠的特異性檢測(cè)這些短核酸序列。該報(bào)道包括以下指示:使用富集的50到少于150個(gè)堿基對(duì)的DNA片段觀察到了 25和39個(gè)堿基對(duì)而非65或88個(gè)堿基對(duì)的擴(kuò)增子的擴(kuò)增的增加。另外，65個(gè)堿基對(duì)擴(kuò)增子的擴(kuò)增被指示為歸因于150-200個(gè)堿基對(duì)的DNA片段。
[0056]本公開內(nèi)容部分基于通過使用約51至約65個(gè)堿基對(duì)的擴(kuò)增子可檢測(cè)少于150個(gè)堿基對(duì)的TR-DNA的發(fā)現(xiàn)。相對(duì)于美國(guó)公開20100068711，這反映了預(yù)料不到的發(fā)現(xiàn)。
[0057]因此，并且在包括測(cè)序靶TR-NA序列的實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容包括測(cè)序約110個(gè)核苷酸或更少、約105個(gè)核苷酸或更少、約100個(gè)核苷酸或更少、約95個(gè)核苷酸或更少、約90個(gè)核苷酸或更少、約85個(gè)核苷酸或更少、約80個(gè)核苷酸或更少、約75個(gè)核苷酸或更少、約70個(gè)核苷酸或更少、約65個(gè)核苷酸或更少、約60個(gè)核苷酸或更少、約55個(gè)核苷酸或更少、或約50個(gè)核苷酸或更少的長(zhǎng)度。在一些情況下，測(cè)序的最小長(zhǎng)度將為51個(gè)核苷酸或更多。因此，測(cè)序從51至約110個(gè)核苷酸長(zhǎng)度預(yù)期用于本發(fā)明的實(shí)踐。
[0058]預(yù)料不到的效果的另一個(gè)基礎(chǔ)是在無細(xì)胞DNA片段中可能存在單鏈斷裂(切口)。因此，擴(kuò)增子越長(zhǎng)，模板序列中的單鏈斷裂妨礙擴(kuò)增子成功擴(kuò)增的可能性越大。換句話說，PCR反應(yīng)使用以其單鏈形式的模板，這增加了無細(xì)胞TR-DNA中單鏈斷裂的有害效果。這些考慮以前導(dǎo)致長(zhǎng)度不超過50個(gè)堿基對(duì)的PCR測(cè)定設(shè)計(jì)。
[0059]在許多實(shí)施方案中，可使用定量PCR(qPCR)諸如實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)實(shí)踐本公開內(nèi)容。一些系統(tǒng)包括使用3個(gè)靶序列特異性的組分:2條引物和I條標(biāo)記的TaqMan探針，然而，替代性的qPCR方法通過使用標(biāo)記的引物消除了分離TagMan探針的需要。在使用標(biāo)記的引物的本公開內(nèi)容的實(shí)施方案中，由于DNA聚合使用標(biāo)記的引物，得到的引物延伸產(chǎn)物及擴(kuò)增的核酸分子也會(huì)被標(biāo)記。本公開內(nèi)容清楚地包括包含這些標(biāo)記的產(chǎn)物和擴(kuò)增子的物質(zhì)的組合物。另外，并且當(dāng)將銜接子或接頭連接至TR-NA時(shí)，本公開內(nèi)容清楚地包括包含這些修飾的TR-NA的物質(zhì)的組合物，以及包含修飾的TR-NA的延伸產(chǎn)物或擴(kuò)增產(chǎn)物的物質(zhì)的組合物。
[0060]本公開內(nèi)容可用于許多應(yīng)用，包括但不限于分析病原體核酸的存在、檢測(cè)指示癌癥的核酸的存在、檢測(cè)指示胎兒中遺傳疾病的核酸的存在、分析胎兒的核酸的存在、分析特定的宿主及特定的非宿主核酸序列的存在、用于分析靶核酸的甲基化形式與程度、檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性以及法醫(yī)學(xué)分析。
[0061]病原體是能夠引起其宿主的疾病的生物物質(zhì)。病原體的同義詞是“感染性物質(zhì)”。術(shù)語“病原體”最經(jīng)常用作干擾多細(xì)胞生物體的正常生理學(xué)的物質(zhì)。病原體可選自病毒、細(xì)菌、真菌、支原體及原生動(dòng)物。
[0062]感染是微生物在身體組織中的侵入和增殖，由于競(jìng)爭(zhēng)性代謝、毒素、細(xì)胞內(nèi)復(fù)制或抗原抗體反應(yīng)，感染可以是臨床上不明顯的或?qū)е戮植考?xì)胞損傷。
[0063]本公開內(nèi)容的方法適用于所有病毒病原物質(zhì)，包括RNA病毒、DNA病毒、游離的(episomal)病毒及整合的病毒。它們還適用于重組病毒，例如用于基因治療中的腺病毒或慢病毒。感染性病毒的實(shí)例包括:反轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)(例如，人免疫缺陷病毒，諸如HIV-1，還被稱作HTLV-1I1、LAV或HTLV-1II/LAV或HIV-111 ;及其他分離株，諸如HIV-LP);小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如，骨髓灰質(zhì)炎病毒、甲型肝炎病毒；腸病毒、人柯薩奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)；杯狀病毒科(Calviviridae)(例如，弓丨起腸炎的毒株)；披膜病毒科(Togaviridae)(例如，馬腦炎病毒、風(fēng)疹病毒)；黃病毒科(Flaviridae)(例如，登革熱病毒、腦炎病毒、黃熱病毒)；冠狀病毒科(Coronaviridae)(例如，冠狀病毒)；彈狀病毒科(Rhabdoviridae)(例如，水皰性口炎病毒、狂犬病病毒)；絲狀病毒科(Fidoviridae)(例如，埃博拉病毒)；副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如，副流感病毒、腿腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞體病毒)；正黏病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒)；布尼亞病毒科(Buiigaviridae)(例如，漢坦病毒、布尼亞病毒(bunga virus)、白蛉病毒和內(nèi)羅病毒);砂粒病毒科(Arenaviridae)(出血熱病毒)；呼腸孤病毒科(Reoviridae)(例如，呼腸孤病毒、環(huán)狀病毒和輪狀病毒)；雙核糖核酸病毒科(Birnaviridae);嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒);細(xì)小病毒科(Parvoviridae)(細(xì)小病毒)；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳頭瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(大多數(shù)腺病毒)；皰疹病毒科(Herperviridae)(單純皰疹病毒(HSV) I和2、水痘帶狀皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒(CMV)、皰疹病毒)；痘病毒科(Poxyiridae)(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；以及虹彩病毒科(Iridoviridae)(例如，非洲豬瘟病毒)；以及非典型的病毒(例如，海綿狀腦病的病原體、丁型肝炎的病原體(被認(rèn)為是乙型肝炎病毒的缺陷型衛(wèi)星)，非甲型、非乙型肝炎的病原體(I類-內(nèi)部傳播的；2類-腸道外傳播的(即，丙型肝炎病毒)；諾沃克及相關(guān)病毒，以及星狀病毒)。
[0064] 本公開內(nèi)容的方法適用于所有的細(xì)菌病原物質(zhì)。感染性細(xì)菌的實(shí)例包括:幽門螺桿菌(Helicobacter pyloris)、疏螺旋體屬(Borrelia)(例如，阿氏疏螺旋體(Borrelia afzelii)、鷦包柔氏螺旋體(Borrelia anserine)、伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)、伽氏疏螺旋體(Borrelia garinii)、赫姆斯疏螺旋體(Borrelia hermsii)、回歸熱疏螺旋體(Borrelia recurrentis)、法雷斯疏螺旋體(Borrelia valaisiana)、及奮森氏疏螺旋體(Borrelia vincentii));立克次氏體屬(Rickettsia)(例如，貓立克次體(Rickettsia felis)、普氏立克次體(Rickettsiaprowazekii)、立氏立克次體(Rickettsia rickettsii)、斑疫傷寒立克次體(Rickettsiatyphi)、康氏立克次體(Rickettsia conorii)、非洲立克次體(Rickettsia africae)或小蛛立克次體(Rickettsia akari));嗜肺軍團(tuán)菌(Leg1nella pneumophilia))、分枝桿菌sps (例如，結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)、鳥分枝桿菌(M.avium)、胞內(nèi)分枝桿菌(M.1ntracellulare)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansaii)、戈登分枝桿菌(M.gordonae))、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)、單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、釀胺鏈球菌(Streptococcuspyogenes) (A 群鏈球菌)，無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae) (B 組鏈球菌)，鏈球菌屬(Streptococcus)(草綠色群(viridans group))、類鏈球菌(Streptococcus faecalis)、牛鏈球菌(Streptococcusbovis)、鏈球菌屬(厭氧sps.)、肺鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、致病性彎曲桿菌 sp.(pathogenic Campylobacter sp.)、腸球菌屬種(Enterococcussp)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza)、炭疽桿菌(Bacillus antracis)、白喉?xiàng)U菌(corynebacteriumdiphtheriae)、棒狀桿菌(corynebacteium)屬種、紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrixrhus1pathiae)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium penfiingers)、破傷風(fēng)梭菌(Clostridiumtetani)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter erogenes)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneuomiae)、多殺性巴氏桿菌(Pasturella multicoda)、擬桿菌屬種(Bacteroides sp.)、具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠狀鏈桿菌(Sreptobacillus moniliformis)、梅毒螺旋體(Ti^ponema