一種純化制備n-磺酰氨甲?；舅氐姆椒?br>【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物檢測領(lǐng)域，具體的說涉及一種純化制備N-磺酰氨甲酰基毒素 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 麻痹性貝類毒素（PSTs)是水體中浮游藻類或微生物產(chǎn)生的一類水溶性極強(qiáng) 的小分子次生代謝產(chǎn)物。其基本結(jié)構(gòu)是兩個胍基的四水化嘌呤多疊六元環(huán)。根據(jù)取代 基團(tuán)的不同，主要分為四類：①氨基甲酸酯類毒素（Carbamatetoxins)，包括石房蛤毒 素（Saxitoxin，STX)、新石房蛤毒素（neoSTX，ΝΕ0)和膝溝藻毒素l_4(Gonyautoxins， GTX1-4);②N-磺酰氨甲?；惗舅兀∟-sulfocarbamoyltoxins)，包括GTX5 (B1)、 GTX6(B2)和C1-C4 ;③脫氛甲醜基類毒素（Decarbamoyltoxins)，包括dcSTX、dcneoSTX、 dcGTXl-4;④脫氧脫氛甲醜基類毒素（Deoxydecarb-amoyltoxins)，包括doSTX、doneoSTX 和doGTXl等。
[0003]PSTs是一類高效的鈉離子通道神經(jīng)毒素。當(dāng)人體攝入了被PSTs污染的海產(chǎn)品 后，臨床初期主要表現(xiàn)為嘴、唇、舌發(fā)麻，四肢出現(xiàn)麻痹癥狀，感覺出現(xiàn)異常，人變得虛弱和 混亂；后期主要表現(xiàn)為惡心，嘔吐，呼吸急促，頭痛發(fā)燒，吞咽困難，血壓異常，嚴(yán)重者出現(xiàn)意 識模糊甚至死亡。N-磺酰氨甲?；惗舅仉m然其本身毒性較小，但是在生物體內(nèi)極易通過 生物轉(zhuǎn)化脫去磺?；桶被姿狨ユ溕啥拘院軓?qiáng)的STX和脫氨甲?；惗舅?。另外，最 新的生物轉(zhuǎn)化實驗也發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)了在貝類水產(chǎn)品體內(nèi)存在C1/C2毒素。
[0004] 為保障公眾不受PSTs的威脅，世界許多國家、地區(qū)及相關(guān)國際組織都已經(jīng)對貝類 水產(chǎn)品進(jìn)行嚴(yán)格管理和控制，并制定了相應(yīng)的貝類水產(chǎn)品及其制品的PSTs限量標(biāo)準(zhǔn)。但 PSTs標(biāo)準(zhǔn)品價格昂貴，因此相關(guān)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制備與純化技術(shù)受到尚度關(guān)注。
[0005] 由于毒素來源的不穩(wěn)定性，PSTs純化技術(shù)一直是該類毒素定量與定性分析的重 點和難點。目前PSTs純化的毒素主要來源是天然海域中分離純化得到的產(chǎn)毒藻株。但有 很大一部分藻株不具備培養(yǎng)條件，已有報道培養(yǎng)條件并能夠小規(guī)?；B(yǎng)殖的產(chǎn)毒藻種只有 A.catenella、A.tamarense(AT，塔瑪亞歷山大藻）和A.minutum等少數(shù)幾個。但是對產(chǎn)毒 藻AT的培養(yǎng)仍然沒有系統(tǒng)的、最佳的方法。
[0006] 因此有必要建立了一種可以制備純化N-磺酰氨甲?；惗舅胤椒ǎ瑸橄嚓P(guān)水產(chǎn) 品質(zhì)量安全監(jiān)管提供技術(shù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種純化制備N-磺酰氨甲酰基毒素的方法，該方法包括 如下步驟：
[0008] (1)產(chǎn)毒藻的培養(yǎng)：將AT的純藻株在無菌條件下接入含營養(yǎng)鹽的人工海水中，純 藻株液和人工海水體積比為1:2,在f/2培養(yǎng)基、溫度23°C、鹽度2. 8-3. 2% (優(yōu)選的鹽度為 3. 0% )、pH7. 5-8. 5(優(yōu)選的pH為8. 0)、光強(qiáng)160001ux和光暗比14L:10D的條件下進(jìn)行 藻株的培養(yǎng)，培養(yǎng)時間5天；
[0009] (2)毒素的提?。涸逡航?jīng)0.22μπι濾膜抽濾，取膜上的藻體以體積比為1 :2加入提 取液，室溫提取兩次，每次10min，4500rpm離心lOmin后合并兩次提取液，-20°C冷凍4h棄 去上層乙腈層，即得到毒素的粗提液；其中提取液為乙腈、水和甲酸按照80 :19. 9 :0. 1的體 積比配制而成；
[0010] ⑶毒素的收集與純化：取粗提液〇. 5mL進(jìn)入GPC(G-15)純化系統(tǒng)，在0. 1%乙酸 為流動相的等度條件下洗脫，流速設(shè)為2. 50mL/min，設(shè)置流出液的收集時間，用自動收集器 收集；收集得到的流出液冷凍干燥至盡干并用〇. 1 %乙酸定容至lmL，過0. 22μm濾膜，進(jìn) LC-MS/MS對產(chǎn)毒種類進(jìn)行定性；采用HPLC-FLD柱后衍生-峰面積歸一法計算毒素純度。
[0011] 其中步驟（3)中所使用的液相分析條件具體如下：
[0012] 色譜柱：TSK-gelAmide-80 親水柱（150X2mm，3ym);柱溫：30°C;流速：0· 3mL/ min;進(jìn)樣量：5μL;
[0013] 流動相：A相：乙腈；B相：3. 6mM甲酸、2mM甲酸銨水溶液（pH3. 5);
[0014] 梯度洗脫程序：0min, 15%B;0-10min，45%B;10-llmin，45%B;ll-14min，15% B, 14-19,min15%B〇
[0015] 步驟（3)中所使用的質(zhì)譜分析條件具體如下：
[0016] 離子源模式：正離子模式（ESI+);噴霧電壓：4.Okv(ESI+);加熱塊溫度：300°C;離 子傳輸管溫度：350°C;鞘氣：氮氣，流量35arb;輔助氣：氮氣，流量20arb;碰撞氣：氬氣，碰 撞壓力1. 5mTorr;毒素的質(zhì)譜參數(shù)見表1。
[0017] 步驟（3)中所使用色譜及衍生條件如下：
[0018] 色譜柱：AgleaVenusilXBPC8 (4. 6X150mm，5μm);流動相（等度）：2mM四丁基 磷酸銨水溶液（10%乙酸或1 %氨水單向調(diào)節(jié)pH至5.8);流速：0. 8mL/min;柱后衍生劑： lOOmM磷酸+5mM高碘酸水溶液（5MNaOH調(diào)節(jié)pH至7. 8)，流速0. 4mL/min;酸化劑：0. 75M 硝酸，流速〇. 4mL/min;柱溫：20°C;衍生池溫度：85°C;熒光檢測器參數(shù)：激發(fā)波長：330nm; 發(fā)射波長：390nm;進(jìn)樣量：10μL〇
[0019] 本發(fā)明還提供了一種塔瑪亞歷山大藻的培養(yǎng)方法，將AT的純藻株在無菌條件下 接入含營養(yǎng)鹽的人工海水中，純藻株液和人工海水體積比為1:2,在f/2培養(yǎng)基、溫度23°C、 鹽度2.8-3.2%(優(yōu)選的鹽度為3.0%)、？!17.5-8.5(優(yōu)選的？!1為8.0)、光強(qiáng)1600011?和 光暗比14L:10D的條件下進(jìn)行藻株的培養(yǎng)，培養(yǎng)時間5天。
[0020] 本發(fā)明通過優(yōu)化塔瑪亞歷山大藻的培養(yǎng)條件，使得其能夠保持最高活力進(jìn)行增 殖，進(jìn)而產(chǎn)生最大量的PSTs，此株藻種能產(chǎn)生C1/C2以及GTX2/GTX3四種PSTs的組分，其中C2含量最高，可達(dá)到90%以上；經(jīng)葡聚糖凝膠G-15純化后，將C1/C2與GTX2/3完全分離； 通過調(diào)整收集時間可以得到純度在91%以上的C1/C2。此技術(shù)與現(xiàn)有技術(shù)相比，方法簡單， 毒素純度較高。
【附圖說明】
[0021] 圖1為毒素粗提液經(jīng)葡聚糖凝膠G-15進(jìn)行毒素純化的回收率。
[0022] 圖2為毒素純化后的C1/C2HPLC-FLD色譜圖。
【具體實施方式】
[0023] 下面給出的實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。本發(fā)明是結(jié)合最佳實施例進(jìn)行描述 的，然而在閱讀本發(fā)明實例后，本領(lǐng)域技術(shù)人員能領(lǐng)會并在公開的實施中做許多改變也可 獲得相同或類似的結(jié)果，均屬于本發(fā)明的構(gòu)思和范圍。更具體的說，有些試劑可替代本文所 公開的試劑而得到相同或類似結(jié)果。所有類似的取代或修飾均被認(rèn)為本發(fā)明的構(gòu)思和范 圍，所有上述等價形式均屬于本發(fā)明權(quán)利要求書限定的范圍。
[0024] 實施例1
[0025] 1、材料與方法
[0026] 1. 1主要儀器與試劑
[0027]LC-MS/MS:電噴霧離子源（ESI)(ThermoFisherScientific，USA);
[0028]HPLC柱后熒光衍生系統(tǒng)：Watersalliance2690/2475 (Waters，USA);
[0029]凝膠過濾系統(tǒng)：J2preplincGPC/SPE/evap聯(lián)用儀（J2scientific，USA);
[0030] 培養(yǎng)箱：PQX_350H人工氣候箱，上海申賢恒溫設(shè)備廠；
[0031] 數(shù)字式PH計：PHS-3C，上海雷磁儀器廠；
[0032] 冷凍干燥機(jī)：HetoPowerDryLL3000,上海匯分電子科技有限公司；
[0033] 細(xì)胞粉碎機(jī)：GA98-IIIDB，無錫上佳生物科技有限公司；
[0034] 手持折光儀：0TC，上海天皇儀器儀表有限公司。
[0035] 1.2標(biāo)準(zhǔn)品及試劑
[0036] 毒素標(biāo)準(zhǔn)品（STX，NEO,GTX1/4,GTX2/3,C1/C2)購自加拿大國家研究理事會海洋 生命科學(xué)研究院；甲酸、乙腈、乙酸和葡聚糖凝膠G-15購自國藥化學(xué)試劑有限公司。
[0037] 塔瑪亞歷山大藻種：分離自中國東海長江口海域，由廈門大學(xué)近海海洋環(huán)境科學(xué) 國家重點實驗室提供；
[0038]f/2 培養(yǎng)基的配制參考文獻(xiàn)Guillard,R.R.L. 1975.Cultureofphytoplankton forfeedingmarineinvertebrates,pp26-60.InSmithff.L.andChanleyΜ.H. (Eds.) CultureofMarineInvertebrateAnimals.PlenumPress,NewYork,USA
[0039]2、實驗方法
[0040] 2· 1產(chǎn)毒素藻株培養(yǎng)方法
[0041] 將AT的純藻株在無菌條件下接入含營養(yǎng)鹽的人工海水中，純藻株液和人工海水 體積比為1:2,在f/2培養(yǎng)基、溫度23°C、鹽度3. 0%、ρΗ8. 0、光強(qiáng)160001ux和光暗比14L: 10D的條件下進(jìn)行藻株的培養(yǎng)，培養(yǎng)時間5天。
[0042] 2. 2毒素提取方法
[0043] 藻液經(jīng)0.22μπι濾膜抽濾，取膜上的藻體以體積比為1 :2加入80%的乙腈水（體 積比：乙腈+水+甲酸=80 :19. 9 :0. 1)，室溫提取兩次，每次10min，4500