一種從藻類中提取生物活性物質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種從藻類中提取生物活性物質(zhì)的方法，具體地，涉及一種從藻類中 提取藻膽蛋白和/或多糖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 藻類不僅可以作為食品，還與醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)都有很密切的關(guān)系。以葛仙米 (Nostocsphaeroidskiltz)為例，葛仙米是生于水稻田中的一種可食性藍(lán)藻，屬于藍(lán)藻門 (Cyanophyta)藍(lán)藻綱（Cyanophyceae)念珠藻科（Nostocaceae)中念珠藻屬（Nostoc)植 物，又稱天仙菜、天仙米，也有稱水木耳，是一種淡水藍(lán)藻，是我國傳統(tǒng)珍貴的野生食藥兩用 的藻類。我國的主要分布地是湖北鶴峰縣走馬坪鎮(zhèn)。葛仙米具有：明目益氣、治夜盲癥、久 食延年、解熱清膈、利腸胃、痰火能療和消除疲勞等功效。葛仙米備受民間推崇，但是還缺乏 現(xiàn)代的科學(xué)依據(jù)。迄今為止，人們對(duì)葛仙米的功效成分的化學(xué)本質(zhì)、理化特性、功能性質(zhì)還 缺乏研究。
[0003] 雖然，目前也偶見有關(guān)于單一提取某種生物活性成分的報(bào)道，但未見同時(shí)提取多 種生物活性成分的報(bào)道，特別是對(duì)于葛仙米，由于世界上葛仙米的分布十分稀少，產(chǎn)量也有 限，開發(fā)高效地從藻類中提?。ǘ喾N）生物活性物質(zhì)的方法以為生化本質(zhì)研究提供基礎(chǔ)具 有很重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能夠高效地從藻類中提取生物活 性物質(zhì)（藻膽蛋白和/或多糖）的方法。
[0005] 本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用不同濃度的無機(jī)鹽溶液進(jìn)行鹽析，能夠顯著提高藻膽 蛋白的純度。因此，為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種從藻類中提取生物活性物質(zhì)的方 法，該方法包括以下步驟：
[0006] (1)對(duì)藻類樣品進(jìn)行破壁提取以使藻膽蛋白溶出，固液分離后分別得到粗提液和 固體殘?jiān)?br>[0007] (2)將粗提液與無機(jī)鹽混合進(jìn)行鹽析，無機(jī)鹽的用量使得混合體系中無機(jī)鹽的濃 度為15-25重量％，固液分離取液相；
[0008] (3)選擇性地將步驟（2)固液分離得到的液相與無機(jī)鹽混合進(jìn)行鹽析，無機(jī)鹽的 用量使得混合體系中無機(jī)鹽的濃度為30-55重量％，固液分離并收集沉淀；
[0009] (4)將步驟⑵或步驟⑶固液分離得到的液相與無機(jī)鹽混合進(jìn)行鹽析，無機(jī)鹽的 用量使得混合體系中無機(jī)鹽的濃度為58-65重量％，固液分離并收集沉淀。
[0010] 本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，提取藻膽蛋白后的固體殘?jiān)泻休^高量的多糖， 且通過使用蛋白酶和采用特定的水提方式能夠在水和醇用量較低的前提下更有效地從固 體殘?jiān)ê?或藻類樣品）中提取多糖。因此，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述從藻類中 提取生物活性物質(zhì)的方法還包括上述提取藻膽蛋白步驟以外的提取多糖的步驟：
[0011] ⑴將藻類樣品（和/或固體殘?jiān)┮来闻c堿液和蛋白酶進(jìn)行混合，以使藻類樣品 中的多糖溶出且蛋白質(zhì)發(fā)生水解；
[0012] (II)往體系中補(bǔ)加水進(jìn)行水提，固液分離，其中，水的補(bǔ)加量使得藻類樣品與水提 體系的重量比為1 :20-100;水提的方式為：補(bǔ)加水后在80-1KTC的溫度下提取l_3h，重復(fù) 2-5 次；
[0013] (III)將步驟（II)固液分離獲得的液相濃縮后進(jìn)行醇沉，醇沉所使用的乙醇在醇 沉體系中的含量為28-60重量％。
[0014] 通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明能夠高效地從藻類中提取生物活性物質(zhì)（藻膽蛋白和 /或多糖），收率和純度均較高。而且，在本發(fā)明的上述優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明能夠在一 批藻類原料中同時(shí)獲得藻膽蛋白和多糖兩種生物活性物質(zhì)，在保證收率的前提下節(jié)省了原 料。
[0015] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說明。
【附圖說明】
[0016] 附圖是用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的具 體實(shí)施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：
[0017]圖1是本發(fā)明實(shí)施例1獲得的藻膽蛋白產(chǎn)品的紫外可見掃描分析圖；
[0018]圖2是本發(fā)明實(shí)施例1獲得的多糖樣品的紅外光譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 以下對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體 實(shí)施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0020] 在本發(fā)明中，在未作相反說明的情況下，涉及的藻類樣品和固體殘?jiān)鹊闹亓烤?按干重（115°C下干燥至恒重時(shí)的重量）計(jì)；涉及的液體的體積均為在25°C下測得的體積。
[0021] 本發(fā)明提供了一種從藻類中提取生物活性物質(zhì)的方法，所述生物活性物質(zhì)為藻膽 蛋白和/或多糖，該方法包括以下步驟：
[0022] (1)對(duì)藻類樣品進(jìn)行破壁提取以使藻膽蛋白溶出，固液分離后分別得到粗提液和 固體殘?jiān)?br>[0023] (2)將粗提液與無機(jī)鹽混合進(jìn)行鹽析，無機(jī)鹽的用量使得混合體系中無機(jī)鹽的濃 度為15-25重量％，固液分離取液相（棄固相）；
[0024] (3)選擇性地將步驟（2)固液分離得到的液相與無機(jī)鹽混合進(jìn)行鹽析，無機(jī)鹽的 用量使得混合體系中無機(jī)鹽的濃度為30-55重量％，固液分離并收集沉淀；
[0025] (4)將步驟⑵或步驟⑶固液分離得到的液相與無機(jī)鹽混合進(jìn)行鹽析，無機(jī)鹽的 用量使得混合體系中無機(jī)鹽的濃度為58-65重量％，固液分離并收集沉淀。
[0026] 本發(fā)明中，所述藻類可以為各種已知含有藻膽蛋白和/或多糖的藻類，例如，藍(lán)藻 (Cyanophyta)、紅藻（Rhodophyta)、隱藻（Cryptophyta)和甲藻（Pyrrophyta)中的至少一 種。優(yōu)選情況下，所述藻類為選自色球藻屬（Chroococcus)、微囊藻屬（Microcystis)、顫藻 屬（Oscillatoria)、念珠藻屬（Nostoc)和魚腥藻屬（Anabeana)組成的組中的藍(lán)藻。更優(yōu) 選地，所述藻類為選自念珠藻屬的藻類，最優(yōu)選為葛仙米。
[0027] 本發(fā)明中，所述藻類樣品的粒徑優(yōu)選為100-300μm。可以通過干燥、破碎和過篩等 步驟獲得上述粒徑的藻類樣品。
[0028] 本發(fā)明的步驟（1)中，可以采用常規(guī)的方式進(jìn)行破壁提取，只要能夠使藻膽蛋白 從藻類的細(xì)胞內(nèi)溶出即可。優(yōu)選情況下，所述破壁提取包括依次進(jìn)行緩沖液溶脹、凍融和在 浸提緩沖液的存在下進(jìn)行高速組織勻漿處理。
[0029] 可以按照常規(guī)的方式進(jìn)行緩沖液溶脹。所述緩沖液溶脹的方式可以為將藻類樣品 與pH5-8. 5的磷酸緩沖液混合。相對(duì)于每克的藻類樣品，所述磷酸緩沖液的用量可以為 4-15mL。所述緩沖液溶脹的條件可以包括溫度為4-15Γ，直至充分膨脹為止。
[0030] 可以按照常規(guī)的方式進(jìn)行凍融。所述凍融的方式可以為：反復(fù)在_10°C至_80°C的 條件下進(jìn)行冷凍、解凍，反復(fù)的次數(shù)不少于兩次（如2-4次）。
[0031] 高速組織勻漿處理特別有利于藻類的細(xì)胞壁破裂，可以借助高速組織勻漿機(jī)進(jìn) 行。所述浸提緩沖液優(yōu)選為〇. 04-0.lmol/L的pH5-8. 5的緩沖液（如磷酸氫鹽-有機(jī)酸 緩沖液、磷酸氫鹽-磷酸二氫鹽緩沖液或磷酸二氫鹽-氫氧化物緩沖液，其中，所述有機(jī)酸 可以為檸檬酸；所述磷酸氫鹽可以為磷酸氫二鈉和/或磷酸氫二鉀；所述磷酸二氫鹽可以 為磷酸二氫鈉和/或磷酸二氫鉀；所述氫氧化物可以為氫氧化鈉和/或氫氧化鉀）。相對(duì) 于每克的藻類樣品，所述浸提緩沖液的用量可以為20-50mL。所述高速組織勻漿處理的條件 優(yōu)選包括：溫度為4-15Γ，時(shí)間為3-5h。優(yōu)選地，所述高速組織勻漿處理的方式為間歇式， 以進(jìn)一步防止藻膽蛋白活性不利地受到高溫的影響。
[0032] 本發(fā)明的步驟（1)可以重復(fù)進(jìn)行，以更充分地使藻膽蛋白溶出。
[0033] 本發(fā)明的步驟（2)-(4)中，對(duì)鹽析的條件等沒有特殊的限制，只要能夠使粗提液 中的蛋白質(zhì)凝聚而從溶液中析出即可，例如，所述鹽析的條件包括：溫度為2_8°C，時(shí)間為 6_15h(指每次鹽析的時(shí)間）。對(duì)鹽析使用的無機(jī)鹽的種類沒有特別的要求，可以為常規(guī)的 用于鹽析的無機(jī)鹽，例如，可以為硫酸銨、硫酸鈉和氯化鈉中的至少一種。本領(lǐng)域技術(shù)人員 能夠理解的是：鹽析時(shí)，所述無機(jī)鹽可以以溶液的形式與待進(jìn)行鹽析的溶液混合。
[0034] 本發(fā)明的步驟（3)中，收集沉淀的方式優(yōu)選是反復(fù)多次進(jìn)行鹽析和固液分離，且 無機(jī)鹽的