cerDrugs, 2014, 25:663-672.)〇
[0005] 因此，基于上述單域抗體的獨特優(yōu)勢和抗人NRP-1抗體的研究開發(fā)現(xiàn)狀，制備抗 人NRP-1的單域抗體具有廣闊的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一目的在于提供抗人神經(jīng)纖毛蛋白1單域抗體。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供抗人神經(jīng)纖毛蛋白1單域抗體的制備方法。
[0008] 所述抗人神經(jīng)纖毛蛋白1單域抗體的氨基酸序列（SEQIDN0. 3)為：
[0009] Met AlaMetGluValGinLeuGinGinSerGlyAlaGluLeuMetLysProGlyAlaSer1 S 10 15 20 Val LyslieSerCysLysAlaThrGlyTyrThrPheSerGlyTyrTrplieGluTrpVal21 25 30 35： 40 Lys GinArgProGlyHisGlyL：euGluTrplieGifGlulieLeuPro：GlySerValSer41 45 50 §5 60 lie AsnTyrA：snGluLysGJuLysGlyLys&1&,Thi'.lieThrAlaAspSerPheSerAsn ilmTQ 75 80 Thr AlaTyrMetArgLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrTyrCysAla SI 8:5 側(cè) 9S 100 Asn TrpAspGluAspSerTrpGlyGinGlyThrThr￥alThr?alSpiSpiLeuCiluHis101 105 110 ll?j 120 :His Ris:HisRis:His121 125
[0010] 所述抗人神經(jīng)纖毛蛋白1單域抗體的基因序列（SEQIDNO. 4)為：
[0011] atggccatgg aggtgcaactgeagcagtcaggagctgagctgatgaagcctggggcctca60 gtgaagatat cctgcaaggctactggctacacattcagtgggtactggatagagtgggta 120 aagcagagge:ctggacatggccttgagtggattggagagattttacctggaagtgtcagt180 attaactaca atgagaaattcaagggcaaggccacaatcactgcagattGattttccaac240 acagcctaca tgcgactcagcagtctgacatctgaggactctgccgtctattactgtgca300 aaetgggaet ttgaeteetggggceaagggaecaeggtcacegtetecteaetegagcae360 caccaccacc accac375
[0012] 其中，第13~351位核苷酸為抗人神經(jīng)纖毛蛋白1單域抗體基因（即重鏈可變區(qū) 基因，VH)，共339bp;第352~357位核苷酸為XhoI酶切位點，共6bp;第358~375位核 苷酸為6XHis標簽基因，共18bp。
[0013] 所述抗人神經(jīng)纖毛蛋白1單域抗體的制備方法包括以下步驟：
[0014]1)克隆抗人神經(jīng)纖毛蛋白1單域抗體基因（即重鏈可變區(qū)基因，VH)，并將其導(dǎo)入 載體，構(gòu)建重組載體；
[0015] 2)將重組載體導(dǎo)入宿主細菌，構(gòu)建表達抗人神經(jīng)纖毛蛋白1單域抗體的重組工程 菌；
[0016] 3)將重組工程菌發(fā)酵培養(yǎng)，分離純化發(fā)酵液，即得抗人神經(jīng)纖毛蛋白1單域抗體。
[0017] 在步驟1)中，所述克隆抗人神經(jīng)纖毛蛋白1單域抗體基因的模板來自本實驗室 篩選得到的抗人神經(jīng)纖毛蛋白1單克隆抗體的雜交瘤細胞株A6,所述雜交瘤細胞株A6已 于2015年11月1日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國.武漢.武漢大學(xué)，郵編： 430072,保藏中心保藏編號為CCTCCNO:C2015186;
[0018] 所述克隆抗人神經(jīng)纖毛蛋白1單域抗體基因（即重鏈可變區(qū)基因）的引物為：
[0019] 5 ' 端引物：5，-CATGCCATGGAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3，
[0020] 3' 端引物：5，-CCGCTCGAGTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC-S，；
[0021] 所述載體可為pET-22b(+)質(zhì)粒。
[0022] 在步驟2)中，所述宿主細菌可為E.coliBL21(DE3)。
[0023] 在步驟3)中，所述純化可采用親和層析。
[0024] 本發(fā)明以抗人神經(jīng)纖毛蛋白1單克隆抗體雜交瘤細胞株A6為模板，RT-PCR克 隆獲取該抗體的重鏈可變區(qū)基因（VH);將其導(dǎo)入質(zhì)粒載體pET_22b(+)，構(gòu)建重組載體 pET-22b(+)-VH;將重組載體導(dǎo)入表達菌株E.coliBL21 (DE3)，IPTG誘導(dǎo)人神經(jīng)纖毛蛋白蛋 白1單域抗體的表達，然后對其進行純化與鑒定?；趩斡蚩贵w的獨特優(yōu)勢和抗人神經(jīng)纖 毛蛋白1抗體的研究開發(fā)現(xiàn)狀，制備抗人神經(jīng)纖毛蛋白1單域抗體具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0025] 圖1為抗人神經(jīng)纖毛蛋白1單域抗體基因（即重鏈可變區(qū)基因，VH)的PCR產(chǎn)物 電泳圖。在圖1中，1為〇嫩分子量標記（0嫩1&^1?^)，2為重鏈可變區(qū)基因（￥")的？0?產(chǎn) 物；1500、1000、700、500、300、100為DNA分子量標記的大小（單位：bp)。
[0026] 圖2為純化后的抗人神經(jīng)纖毛蛋白1單域抗體的SDS-PAGE電泳圖。在圖2中，1 為純化后的抗人神經(jīng)纖毛蛋白1單域抗體，2為蛋白分子量標記（ProteinMarker)，116. 0、 45. 0、35. 0、25. 0、18. 4、14. 4 為蛋白分子量大小（單位：kDa)。
[0027] 圖3為抗人神經(jīng)纖毛蛋白1單域抗體原核表達后的SDS-PAGE電泳圖。在圖3中，1 為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的空載體菌蛋白，2為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的菌蛋白，3為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)菌的超聲 破碎沉淀，4為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)菌的超聲破碎上清液，5為蛋白分子量標記（Protein Marker)， 116. 0、66. 2、45. 0、35. 0、25. 0、18. 4、14. 4為蛋白分子量大?。▎挝唬簁Da) ;A為目標蛋白條 帶。
[0028]圖4為抗人神經(jīng)纖毛蛋白1單域抗體的生物學(xué)活性鑒定結(jié)果。在圖4中，橫坐標 為抗人神經(jīng)纖毛蛋白1單域抗體的稀釋度，縱坐標為波長為490nm處的吸光值（0D_J，標 記?為包被融合蛋白NRP-lblb2 ;為包被人胃癌細胞BGC-823總蛋白提取物。
【具體實施方式】
[0029] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的說明，以下所述，僅是對本發(fā)明的較佳實施 例而已，并非對本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示 的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明 的技術(shù)實質(zhì)對以下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0030] 實施例1 :抗人神經(jīng)纖毛蛋白1單域抗體基因（即重鏈可變區(qū)基因，VH)的克隆
[0031] (1)所用細胞和鼠源性抗人神經(jīng)纖毛蛋白1單克隆抗體
[0032] 抗人神經(jīng)纖毛蛋白1單克隆抗體雜交瘤細胞株由廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院抗癌研究中心 研制。上述細胞常規(guī)培養(yǎng)在10%胎牛血清（Gibco)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37°C，5%C02 培養(yǎng)。
[0033] ⑵引物設(shè)計
[0034] 由于要擴增的抗體可變區(qū)基因序列，其CDR序列是未知的，故本發(fā)明使用的引物 采用國際上推廣的引物序列。
[0035]在VH引物的5'端加入酶切位點NcoI ：CATG CCATGG(含保護性堿基CATG)，在VH 引物的3'端加入酶切位點Xho I :CCGCTCGAG(含保護性堿基CCG)〇
[0036] 擴增重鏈可變區(qū)的引物為：
[0037] VH5'端引物（SEQ ID NO. 1) :5，~CATGCCATGGAGGTSMARCTGCAGSAGTCffGG~3r (注： S = G, C ；M = A, C ；R = A, G ；ff = A, T)
[0038]VH3,端引物（SEQIDNO. 2) :5'-CCGCTCGAGTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCC CC-3r
[0039] (3)VH基因的克隆
[0040] 取狀態(tài)良好的雜交瘤細胞株，采用Trizo]? (Invitrogen)試劑，按照說明書上的 方法提取總RNA，以總RNA為模板，以O(shè)ligo(dT) 20 (Τ0Υ0Β0)為隨機引物，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以 01igo(dT)20為隨機引物進行逆轉(zhuǎn)錄（RT-PCR)的方案如下：
[0041]RT-PCR反應(yīng)體系：5XAMV緩沖液 4.0yL;dNTP(10mmol/L)1.0yL;01igo(dT)20 隨機引物（20μmol/L) 2· 0μL;RNase抑制劑 0· 5μL;總RNA5· 0μL;AMV逆轉(zhuǎn)錄酶 1· 0μL; DEPC水 6· 5μL;總體積 20μL。
[0042]反應(yīng)條件：50°C，60min;75°C，15min。反應(yīng)產(chǎn)物于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0043] 然后，以RT-PCR擴增的cDNA為模板，常規(guī)PCR擴增VH基因。
[0044]擴增體系：10XPCR緩沖液 2. 5yL;dNTP(10mmol/L)0. 5yL;5' 端引物（20ymol/ L) 1· 0yL;3' 端（20μ mol/L) 1· 0yL;cDNA1· 0yL;Taq聚合酶 0· 5yL;雙蒸